枸杞多糖抗肿瘤机理研究—细胞凋亡、相关因子基因表达

枸杞子是我国传统的药食兼用的名贵中药材，它具有多方面的药理作用和生物活性功能，本研究室大量工作确证枸杞多糖为其主要的生物活性成分。本文全面系统地研究了枸杞多糖的提取工艺参数，以其中的一纯级分LBP-X为材料对枸杞多糖的理化性质进行了深入研究，采用生命科学前沿技术从细胞凋亡和相关因子基因表达等角度探讨了LBP-X的抗肿瘤作用机制，并对本研究室开发的第三代功能食品—枸杞汁进行了免疫功能评价，其主要研究结果如下： 1 枸杞多糖的提取工艺 枸杞子用4倍体积的溶剂系统1浸泡1.5h后打浆，加溶剂系统2使浓度达到50％，搅拌后抽滤，滤渣用3倍体积的溶剂系统3于60℃回流提取3次，每次1h，挥干溶剂后，滤渣用3倍体积的水于100℃提取4次，每次2h，提取液浓缩后采用Sevag法脱蛋白至少10次以上，多糖液加溶剂系统4至浓度达75％，沉淀脱水干燥后得枸杞总多糖。枸杞多糖总得率为2.35％。 在DEAE-纤维素（OH-）总交换容量为0.8482mmol／g的条件下，DEAE-纤维素（OH-）对枸杞总多糖的交换容量为0.05386g/g，此时枸杞多糖四个级分得到有效分离。各级分经Sephadex G25柱（或透析袋透析2天以上）脱盐纯化，冷冻后各级分得率分别为14.85％、14.06％、18.43％、38.41％（相对于枸杞总多糖）。再经Sephadex G200柱进一步纯化，得枸杞多糖亚级分。LBP-X两亚级分得率分别为7.8％和1.0％（相对于枸杞总多糖）。后面实验中采用的LBP-X为前一亚级分的样品。 采用分光光度法分析了不同品种枸杞多糖四个级分的含量，为枸杞子品质评价提供了依据。 2 LBP-X的理化特性 LBP-X经Sephadex G200柱和SDS-PAGE检测为分子量分布均一的糖蛋白，气相色谱测得其为由阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖六种中性单糖组成的杂多糖，其摩尔比为1.10：1.25：1.76：1.95：1：2.12。LBP-X的中性单糖含量为63.56％，半乳糖醛酸含量为24.80％，蛋白质含量为7.63％。氨基酸自动分析仪测得其含天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、羟基脯氨酸等18种氨基酸，总氨基酸含量为7.5％。凝胶渗透色谱-光散射测得其重均分子量Mw为1.569×10～5，数均分子量Mn为1.422×10～5，分散系数d为1.10，进一步证实了LBP-X为分子量均一级分。SDS-PAGE法测得其分子量为38414。糖肽链连接方式为Glycan-O-Ser。 3 LBP-X抗肿瘤的作用机制 调节机体免疫功能 LBP-X 5，10，20mg/（kg.d）均能显著抑制移植性肿瘤S180的生长，且可显著提高荷瘤鼠胸腺指数，提高巨噬细胞的吞噬功能，促进脾细胞抗体形成，增强淋巴细胞转化反应和CTL杀伤功能。以LBP-X 10mg/（kg.d）效果最佳，接近阳性对照药物Cy的抑瘤率，并且可使荷瘤鼠的免疫功能提高到接近正常小鼠 构祀多糖抗肿瘤机理研究 一细胞凋亡、相关因子基因表达 水平。LBP一X可通过提高机体免疫功能来抑制肿瘤。 .诱导肿翻细胞材亡LBP一X 20mg/1lo00m叭呈剂量依赖性地抑制人白血病 HL一60细胞增殖，且使HL石0的细胞膜流动性降低。HL一60细胞经LBP《作用48h 后，荧光显微镜下细胞核明显固缩、凝聚和断裂，出现浓染致密的颗粒块状荧光: DNA琼脂糖凝胶电泳可见明显的梯状条带，TUNEL方法检测呈阳性;流式细胞仪 分析图上出现典型的凋亡细胞峰。当LBP一浓度为20，100，500，1000m叭时， 细胞凋亡率分别为8.43%，17.70%，27.63%和30.24%。LBP一X可剂量依赖性地诱 导H卜6。细胞凋亡。诱导肿瘤细胞凋亡是构祀多糖抗肿瘤的重要机制。 .增强IL.2、TNF一a墓因表达RT一PCR结果显示:在加入LBP一XS，10，20， 4om岁L培养适当时间后，LBP一X可剂量依赖性地显著提高人外周血单个核细胞IL一2 和TNT一。基因表达水平。与阴性对照组相比，LBP一可使人外周血单个核细胞IL- 2表达水平分别提高1.77、3.92、7.00、7.37倍，TN下.a表达水平分别提高2.38、3.94、 6.06、15.4倍。LBP一X可通过诱生I卜2和TNF一Q来增强免疫功能和抗肿瘤。 4第三代功能食品一构纪汁的免疫调节作用用733m斌kg.bw)、 146.6m斌kg.bw)、22Om城kg.bw)三个剂量的构祀汁灌服小鼠，结果表明，高、中、 低剂量组均能显著增强巨噬细胞吞噬功能，增强ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞增殖 能力和DN[FB诱导的小鼠迟发性变态反应，增强小鼠碳廓清能力，升高小鼠血清 溶血素含量，增强抗体生成细胞能力，且效果呈剂量依赖效应。提示拘祀汁具有免 疫调节作用。此项研究己获国家卫生部保健食品批号。