梨（PyrusL.）AFLP反应体系的建立及在品种鉴定中的应用

AFLP(扩增片段长度多态性)是一种新型的分子标记技术，目前已广泛应用于分子生物学及动植物育种等领域的研究。尽管前人利用分子标记技术对梨也进行了一些研究，但利用AFLP技术进行研究的报道很少。故本研究对影响AFLP技术体系的多方面因素进行了探讨，同时对梨属44个品种(包括6组芽变)进行了DNA水平上的研究，探讨AFLP技术在梨品种鉴定中的应用；通过对梨属部分种质进行鉴定和亲缘关系分析，解决如苹果梨等分类存在争议的品种的归属问题，以期为梨的高密度分子遗传图谱的构建、目标基因的定位和核心种质的确立提供参考。主要研究结果如下： 1．对影响梨AFLP指纹分析的多个因素进行了实验与摸索，最后建立了一套梨AFLP指纹分析的最适体系。该体系中各优化因素为：①模板DNA的浓度为150ng／μL，模板DNA用量为450ng；②酶切体系中，MseⅠ和EcoRⅠ各加入3Units，使用MseⅠ Buffer，反应时间为5h；③连接酶最适用量为1.5Units，反应时间为10h；④连接产物最适稀释倍数为5倍；⑤预扩增产物最适稀释倍数为5倍。 2．对64个引物组合进行筛选，选出10个引物组合对44个梨品种进行扩增，共扩增出371个位点，平均每对引物扩增37.1个位点，其中多态性位点306个，占总扩增位点数的82.5％。 3．初步建立了梨属44个品种的AFLP指纹。利用10个引物组合对44个供试品种进行扩增，其中M-CTT／E-ACG能将44个供试品种(包括6组芽变)全部区分开，充分显示了AFLP鉴别率高的优越性。 4．共有19个品种扩增出特有标记，占供试类型的48.2％。其中属于西洋梨系统的4个品种，分别为红巴梨、保利阿斯卡、朱丽比恩和茄梨；3个来源于新疆梨的品种，分别为库尔勒香梨、早熟句句和黄酸梨；另外还有黄金梨、贵妃、中梨1号等12个品种。 5．对供试44个梨品种AFLP数据结果进行了聚类分析。结果表明，白梨系统与砂梨系统品种首先聚在一起，然后是秋子梨系统，最后与西洋梨系统聚在一起。 6．探讨了苹果梨的分类地位。苹果梨与白梨系统的鸭梨欧氏距离最近为7.416，而与砂梨系统的新星为7.746，与秋子梨系统的小香水为8.062，与西洋梨系统的红茄欧氏距离为9.849。从聚类树状图中可以看出，苹果梨首先与金花4号聚在一起，再与其杂种后代苹香聚在一起，认为将苹果梨归为白梨系统比较适宜。