海南粗榧内生真菌CH1307鉴定及其抗肿瘤活性研究

海南粗榧(Cephalotaxus hainanensis Li)因其根、茎、叶中均含有抗癌活性成分三尖杉酯碱类化合物而备受关注,但由于其生长缓慢、繁殖困难,加之过度采伐、生存环境不断恶化,资源几近枯竭。受红豆杉内生菌产紫杉醇之启发,本课题组致力于从海南粗榧内生菌中寻找新途径。 本研究首先对从海南粗榧韧皮部分离得到的产高三尖杉酯碱的内生真菌CH1307进行了鉴定。ITSrDNA序列系统发育树表明：该菌与链格孢属内的多个种聚在一个分支上,序列同源性达到99.8%以上。形态学分析发现,其在查氏酵母膏琼脂培养基上形成绒状、稍厚、边缘不光滑的褐绿色菌落,其反面颜色为红褐色,直径为7.0cm,并且有浅红褐色的可溶性色素产生,但无渗出液渗出。显微镜下可观察到淡褐色的分生孢子梗,单生,直立,有隔,偶尔有分枝。而分生孢子也为淡褐色,链生,壁光滑,但处于链基部的孢子表面可见明显疣突,倒棍棒形或卵形,向顶端渐细成为锥形喙部,成熟的孢子具有3-7个横隔,有些具有1-3个纵隔,分隔处缢缩。因此确定该菌株为链格孢属细极链格孢(Alternaria tenuissima),本实验室将其命名为细极链格孢CH1307。 采用单次单因子实验方法优化细极链格孢CH1307产高三尖杉酯碱的培养基组成和液态发酵条件,研究了碳源、氮源、无机盐离子、微量元素、生长因子、初始pH值、装液量、接种量、转速、培养温度、培养时间、前体物质等因子对细胞生长和高三尖杉酯碱产量的影响。实验结果表明细极链格孢CH1307的生长和产碱对转速和温度的适应范围较窄；Mg2+、Mn2+、生长因子和前体物质能显著提高高三尖杉酯碱的产量。 首先通过单因素实验筛选出培养条件中对高三尖杉酯碱产量有显著影响的因素,即葡萄糖浓度、硫酸镁浓度、复合Vb浓度和摇床转速,再通过中心组合试验设计,应用响应曲面分析法优化细极链格孢CH1307产高三尖杉酯碱的培养条件。结果表明,葡萄糖浓度和摇床转速对高三尖杉酯碱的产量有显著影响,而硫酸镁浓度和复合Vb浓度的效果则不显著。在实验范围内通过寻优获得细极链格孢CH1307产高三尖杉酯碱的最优培养基组成为：葡萄糖32g/L,蛋白胨2.5g/L, K2HPO41.5g/L, MgSO40.1g/L, KCl1.0g/L, MnSO40.01g/L,复合Vb0.125g/L,初始pH值自然,装液量100mL/250mL,接种量2%,培养条件为25℃,转速为145r/min。在最佳培养条件下,对细极链格孢CH1307的细胞生长、底物消耗及产碱规律进行监测,得到了相应的变化趋势图。 对胞外提取物进行抗肿瘤活性研究发现,其对人肝癌细胞SMMC-7721具有较强的体外抗肿瘤活性。