H-IgG对新生大鼠脑缺血缺氧性损伤的保护作用及机制研究

背景：新生儿窒息，或称为缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy,HIE）是指围生期由窒息引起的急性、亚急性脑损伤。该病具有较高的发病率。流行病学统计，每年由新生儿窒息所导致新生儿死亡大约有920,000例，此外还有110万例与该病相关的流产病例。同时，在存活的缺氧缺血性脑病的患儿中均存在不同程度的后遗症，并长期影响患儿的身心健康。据统计，在存活的新生儿窒息患儿中，大约有超过100万的儿童患有神经系统方面的功能障碍，如：脑瘫，癫痫，智力发育迟缓和学习障碍。 在围产期长时间氧气的缺乏是导致新生儿缺氧缺血性脑损伤的直接原因。在缺氧缺血（hypoxic-ischemic, HI）诱导下，一个复杂的连锁反应被激活，最终导致神经细胞死亡和中枢神经系统的损害。在这个过程中，补体系统起到非常关键的负向作用。在缺氧缺血的条件下，补体系统被激活，从而介导炎症反应，并促进各种细胞因子的合成和释放。最终引起不同程度的缺氧缺血性脑损伤。高剂量人免疫球蛋白G （Humanimmunoglobulin G, H-IgG）可以通过清除有害的补体片段，阻断补体途径，抑制炎症反应，从而减轻缺氧缺血性脑损伤。在小鼠的短暂性大脑中动脉堵塞模型中，给予高剂量的H-IgG能够显著减少脑梗死区的大小以及随后的神经系统功能障碍。并且证实活性补体C3b片段在脑损伤区域大量沉积。 目的：在本实验中，我们采用生后7天的新生大鼠做为研究对象，通过建立缺氧缺血性脑损伤模型来模拟新生儿缺氧缺血性脑损伤。本实验的目的在于评估H-IgG对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的脑保护作用，并对其潜在机制进行初步探讨。为临床治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤提供新的治疗方案及理论基础。 方法：本实验首先建立P7Wistar大鼠幼崽的局灶性缺氧缺血性脑损伤（Hypoxicischemic brain injury）。选择出生后7天的Wistar大鼠幼崽，于麻醉状态下双重结扎左侧颈总动脉，并与两条结扎线之间将颈总动脉剪断。恢复1小时后，将其放入持续通有8%氧气的密闭缺氧罐内1小时或2小时。然后取出放回母鼠处。整个模型建立过程，监测体温，使其保持在37.0±0.5℃。实验分组：（1）假手术组，1小时缺氧缺血组，2小时缺氧缺血组；（2）假手术组，单纯缺氧缺血组，溶剂组，或vehicle组，高剂量H-IgG组（2.0g/kg）；（3）假手术组，造模前预处理vehicle组，预处理H-IgG组，缺氧缺血后1小时给予vehicle组，缺氧缺血后1小时给予高剂量H-IgG组；（4）假手术组，vehicle组，高剂量H-IgG组（2.0g/kg），中等剂量H-IgG组（1.0g/kg），低剂量H-IgG组（0.5g/kg）。对不同恢复时间脑组织的组织学研究采用H&E染色。对于H-IgG对缺氧缺血性脑损伤的保护作用的评估通过TTC染色评估脑损伤程度。行为学研究：对于脑损伤急性期，亚急性期及长期的大脑功能评估通过nerological scale及以下几个测试实验来评估：（1）righting reflect实验；（2）wirehanging test；（3）foot fault test。通过western blot，检测幼鼠经历缺氧缺血性脑损伤之后血清及脑组织内补体C3水平的变化情况，以及评估给予IgG之后幼鼠血清及脑组织内补体C3的水平，并与对照组及假手术组进行比较。通过immunochemistry，直观地观察补体C3在新生大鼠幼崽缺氧缺血性脑损伤后在脑组织中分布的部位，以及在给予H-IgG治疗后脑组织内补体C3的清除情况，并与对照组进行比较分析。 结果：生后7天的新生大鼠幼崽在永久性结扎一侧颈总动脉后给予1小时或2小时缺氧。通过TTC染色进行脑损伤程度的评估。结果显示2小时缺氧组可以建立比较稳定的新生大鼠幼崽缺氧缺血脑损伤模型，而1小时缺氧组变异度较大。两组之间有统计学差异（X2=20.417,p=0.000,图4.1B）。对缺氧缺血性脑损伤后的新生大鼠幼崽给予高剂量H-IgG治疗，结果显示给药组与对照组相比，可以显著减少脑梗死的体积及脑水肿。（P<0.01,Student T test）（如图4.3.1所示）。我们比较了不同时间点给予H-IgG治疗。结果显示，与对照组相比，损伤前、后1小时给予H-IgG治疗均能显著减少脑梗死的体积及减轻脑水肿（p<0.01,Student T Test）。两个给药组之间无统计学差异（p>0.05, Student T Test）（如图4.3.2所示）。此外，我们对不同给药剂量对出生后7天新生大鼠幼崽缺氧缺血性脑损伤的作用进行了比较。结果显示，与对照组相比，高剂量H-IgG（2.0g/kg）和中等剂量的H-IgG（1.0g/kg）对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤均有脑保护作用（分别为p<0.01和p<0.05, Student T Test）。而低剂量H-IgG（0.5g/kg）与对照组之间无统计学差异（p>0.05, Student T Test）。通过行为学研究，与假手术组相比，新生大鼠对侧肢体感觉运动功能明显受限，给予高剂量H-IgG(2.0g/kg)，新生大鼠对侧肢体感觉运动功能明显改善。 通过western blot检测新生大鼠幼崽脑组织中补体C3在缺氧缺血性脑损伤后及给予H-IgG治疗后的变化情况。结果显示，与假手术组相比，新生大鼠缺氧缺血性脑损伤24h后脑组织中补体C3明显增多，而给予H-IgG治疗组可以显著抑制这一情况的发生。高剂量H-IgG组（2.0g/kg）与对照组相比具有统计学差异（p<0.05, Student TTest）。通过Immunochemistry观察在缺氧缺血性脑损伤后补体C3在脑组织中靶向的具体位置。应用绿色荧光标记二抗，结果显示，与对侧大脑半球及假手术组同侧大脑半球相同区域相比，补体C3定向沉积于受损伤的神经细胞。而给予高剂量H-IgG治疗后，补体C3的活性被显著的抑制。结论： （1）在新生大鼠HI模型中，可以引起缺氧缺血性脑损伤的最低缺氧时间为1小时，损伤程度随缺氧时间的延长而逐渐加重。2h HI可以产生较稳定的脑损伤模型。 （2）H-IgG对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤具有保护作用： 1．H-IgG的脑保护作用具有剂量依赖性：高剂量H-IgG（2.0g/kg）对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤具有明显的脑保护作用；中等剂量H-IgG（1.0g/kg）对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤也具有一定的脑保护作用，但效果不如高剂量H-IgG组。 2．H-IgG的脑保护作用具有时间依赖性：缺氧前1小时给药与缺氧后1小时给药均具有脑保护作用。 （3）H-IgG不仅对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤急性期具有脑保护作用，而且对于缺氧缺血性脑损伤的新生大鼠的生长发育障碍也具有明显的改善。 （4）H-IgG对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤的脑保护作用可能是通过清除补体C3b，从而抑制炎症反应。 总之，本实验通过建立出生后7天新生大鼠缺氧缺血模型，证实了高剂量的H-IgG对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤具有显著的脑保护作用，为治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤及相关疾病提供了新的思路。