莲房原花青素及其生物、药理活性研究

原花青素类化合物以其显著的抗氧化效果和特有的生物活性及药理作用而引起世界各国科学家的广泛关注，其中葡萄籽原花青素长期以来一直是研究的焦点。在对葡萄籽原花青素的研究不断深入完善的同时，各国科学工作者已将注意力转向其它的植物，希望能寻找和发掘新的植物资源。莲房作为传统已开拓的中药材已为人所熟知，但对其主要活性成分知之甚少。本课题利用近代分析技术和现代生物化学、药理实验方法首次对莲房中的原花青素及其生物、药理活性进行了研究，并从细胞水平探讨了莲房原花青素抗心肌缺血机理。同时还初步证实了莲房原花青素抗氧化、抗肝氧化损伤、抗心肌缺血和降脂等多种功效，首次发现原花青素是莲房的主要活性成分之一，为莲房原花青素进一步的深入研究和莲资源的综合利用提供了实验基础和理论根据。主要结果如下： 1 莲房原花青素的制备、初步结构表征和理化特性 首次分析测定了莲各非可食部位（荷梗、藕节、荷叶、莲房等）中原花青素的含量，其中以莲房的原花青素含量最高，达7.8％。因此确定莲房为研究对象，采用丙酮-水作为浸提溶剂，从莲房中提取原花青素，经Sephadex-LH20柱层析分离纯化，得到莲房原花青素（LSPC），其纯度大于98％。 LSPC为浅黄色粉末，水溶性好，能产生典型的花色素反应，具有较维生素C更强的还原能力和抗氧化活性。在弱酸性条件下较为稳定，而在碱性、强酸性条件下易氧化聚合或降解。金属离子(Fe2+、Pb2+、Zn2+、Cu2+、Al3+)、温度、光照对LSPC都有明显的影响。 紫外光谱分析结果显示LSPC和葡萄籽原花青素均在280 nm处有特性吸收峰。二者的红外吸收光谱图也均与儿茶素基本相同，在3400～3200 cm-1处有强的羟基伸缩振动吸收峰；在～1600cm-1、～1500cm-1、1450cm-1处显示苯环骨架特征振动吸收，表明LSPC含苯环结构；图中～1160 cm-1、～1120 cm-1和～1040 2莲房原花青素及其生物、药理活性研究 cm-’为毗喃环构型的特征吸收峰。Esl一MS图分析结果表明LsPC的主要组分分 子量范围为290一1 1 54，其主要的而z（M+H）+峰在291.1、579，2、731.2、867.2、 1019.4和1155.3，说明LSPC中包含原花青素单体和2～4聚体及原花青素二聚 桔体酸单酷和三聚体桔酸单酷。超导核磁共振碳谱和氢谱分析结果进一步证明 了LSPC主要是由儿茶素和表儿茶素组成的以C4一C:连接的二至四聚体。 2 LSPC抗氧化活性的研究 对LSPC抗油脂氧化、清除自由基、抑制脂肪氧合酶作用以及保护大鼠红细 胞自氧化损伤作用进行了研究，结果表明:LSPC在添加量为0.1%时，对豆油 自动氧化有显著的抑制作用，且效果优于BHT;LSPC对脂肪氧合酶也显示出很 强的抑制效果，当LsPC浓度为62‘5 p g/ml时，抑制率大于90%，其IC50值为 ZI.6p留ml;LSPC在 Fenton体系中抑制轻基自由基的能力较强，且在浓度为 10～1000 p g/ml范围不显示助氧化作用，其ICS。值为266.8 pg/ml，最大抑制率 为90.1%;浓度在31。2 pg/ml时的LSPC能有效地保护红细胞免于因外部因素 诱导而引起的自身氧化损伤，对MDA生成的抑制率达91 .2%。 3 LSPC对肝脏抗氧化功能的影响 观察了LSPc对体外大鼠肝匀浆、线粒体温育和Fe2+、HZo:诱导肝匀浆生成MDA 的影响，结果显示:LsPc在浓度为2一8 mg/ml内都能明显减少体外Fe2+和H202 诱导肝匀浆MDA的生成，对线粒体MDA也显示明显的抑制作用，当LSPC浓 度为0.1 3 pg/ml时，抑制率达到92.3%，提示LSPC的抗氧化活性与其还原特性 和鳌合能力密切相关;体内急性肝损伤的实验结果发现:预防性口服100～200 mg/ml剂量的LsPC能有效地防止5%CCI;油溶液（10ml/k 9 bw）对肝脏的损伤， 并能显著降低MDA含量、提高GST及SOD活性（P<0.01）。提示LSPC通过保 护SOD和GST酶的活性，巩固了肝脏中自由基的产生与抗氧化能力的平衡关系， 以抑制膜脂质过氧化产物MDA的产生来达到抗氧化损伤的作用。 4 LSPC对实验性心肌缺血、离体心脏、心肌细胞的作用 本文着重对LSPC抗心肌缺血的作用进行了较为详细地研究。以Diltiazem 和复方丹参为阳性对照，观察了预防性口服LSPC对异丙肾一L腺素（Isop）心肌 损伤模型、治疗性口服LSPC对lsop心肌损伤模型和大鼠冠脉结扎引起急性心 肌缺血模型以及LSPC对离体心脏、心肌细胞的影响，结果表明:LSPC可剂量 依赖性拮抗IsoP引起大鼠心肌酶释放量和心肌钙含量的增加，缩小心肌梗死面 积，并可缓解心肌组织病理损伤程序，升高超氧化物歧化酶与丙二醛的比值。 其中剂量为100 mg/kg LSpC的效果明显优于Diltiazem（10 mg/kg）和复方丹参 华中农业大学2001届博士学位论文 （8 mg/ kg）(P<0.01)。离体心脏灌流试验显示LSPC能显著减少大鼠离体心脏 的冠脉流量，而且无明显稳定心肌细胞搏动频率或减少心肌细胞对苔盼蓝摄取 率的作用。提示LSPC可能不是直接作用于心脏、保护心肌细胞来防治心肌缺血 损伤。至于其他的作用机制尚待进一步研究。 5 LSPC对实验性高血脂兔及其肝组织形态学的影响 对实验性高血脂兔治疗性给药研究结果显示:与对照组相比，100mg瓜g剂 量组的血清