背景与目的:骨质疏松症(osteoporosis,OP)是以骨吸收增强而骨形成缓慢为特征的一种骨代谢障碍疾病。目前,临床在用的一些抗骨质疏松药物,尽管有些药物疗效显著,但也出现副作用明显,或长期疗效还不明确,或价格昂贵造成患者依从性低等缺点。寻找一种天然,安全有效的植物化学物较为不错的选择。课题组前期研究显示黄精多糖(Polygonatum Sibiricum Polysaccharide,PSP)能促进骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells,BMSCs)成骨分化,具体机制是PSP通过影响Wnt/β-catenin通路中下游效应分子β-catenin表达和入核从而促进骨髓间充质干细胞成骨分化,但不通过该通路的上游LRP5分子激活途径。我们推测可能存在其它途径或者信号通路参与了PSP促进BMSCs的成骨分化。本实验从体内探究PSP对去卵巢大鼠的抗骨质疏松作用;更进一步探究PSP在体外促进BMSCs成骨分化的作用以及可能分子机制,为PSP抗骨质疏松的临床应用提供实验依据。方法:1.去卵巢法建立绝经后骨质疏松大鼠动物模型。(1)所有大鼠以体重匹配,按随机数字表随机分组,包括高、中剂量黄精多糖组(H-PSP、M-PSP),唑来膦酸盐组(ZOL),模型组(OVX)和假手术组(SHAM);(2)各组大鼠隔天灌胃,每周测量体重;(3)PSP干预12周,收集大鼠子宫并称重;(4)Micro-CT胫骨扫描,行骨密度(BMD)以及骨形态计量学分析,包括:骨小粱数量(Tb.N)、骨体积分数(BV\TV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小粱分离度(Tb.Sp)等指标;(5)HE染色行骨组织病理学观察;(6)Real-time PCR分析大鼠骨组织中与成骨破骨分化相关基因mRNA表达。2.建立BMSCs细胞模型。(1)BMSCs培养,倒置显微镜观察细胞生长状态和变化;(2)PSP处理BMSCs 24h,48h,72h后CCK-8法检测细胞增殖;(3)PSP成骨诱导BMSCs 7天和28天后,碱性磷酸酶染色和茜素红S染色并定量分析,Real-time PCR分析成骨分化关键基因(ALP、Runx2、OCN)mRNA的表达;(4)PSP处理BMSCs后24h,48h,72h后Real-time PCR分析Hippo通路相关基因(MST1、TAZ)mRNA的相对表达,Western-blot检测Hippo通路相关蛋白(MST1、p-MST1、TAZ、p-TAZ)的表达水平。结果:(1)0周时各组大鼠体重之间均无统计学差异,12周时模型组大鼠体重较假手术组增加明显,唑来膦酸盐和PSP各剂量组大鼠体重较模型组显著降低;(2)12周时假手术组大鼠子宫形态正常,去卵巢大鼠各组子宫呈不同程度萎缩,与模型组子宫湿重相比,PSP各剂量组均无显著性差异,而唑来膦酸盐组子宫湿重增加显著;(3)与假手术组相比,模型组大鼠骨密度,骨体积分数,骨小梁数量较假手术组降低明显,而骨小梁分离度增加明显;与模型组相比,唑来膦酸盐和PSP各剂量组大鼠骨密度,骨体积分数和骨小梁数量显著增加,而骨小梁分离度显著降低,但各组骨小梁厚度之间无统计学差异;(4)HE染色显示假手术组骨小梁结构正常,致密,连续,间隙正常,充满大量骨髓基质干细胞,而去卵巢组大鼠骨小梁数量呈不同程度降低和破坏,间隙增大,模型组和中剂量PSP组骨小梁破坏明显;(5)骨组织Real-time PCR分析显示,模型组成骨(ALP、Col1a1、Runx2、OCN)和破骨(ACP5、CTSK)分化相关基因相对表达较假手术组显著增强;与模型组相比,高剂量PSP能明显促进成骨分化相关基因表达,抑制了破骨分化相关基因表达,唑来膦酸盐组能明显抑制破骨分化相关基因表达而对成骨分化相关基因无影响;(6)P6代BMSCs为长梭形,细胞突触较长,呈集落生长,长满时为旋涡状,经成骨诱导后细胞变为短梭型,细胞质内黑色颗粒增多;(7)CCK-8实验显示PSP(0-50mg/L)浓度在24h,48h,72h时均不影响细胞增殖;(8)分别行7天和28天成骨诱导,碱性磷酸酶染色和茜素红S染色显示各浓度组PSP处理均能促进BMSCs的成骨分化和矿化,且25mg/L PSP组作用最明显;与对照相比,25 mg/L PSP能明显促进成骨分化相关基因(ALP、Runx2、OCN)表达;(9)25 mg/L PSP分别诱导BMSCs 24h,48h,72h,Real-time PCR分析显示PSP在48h时能促进TAZ基因表达,差异有统计学意义,而对MST1基因表达无影响;Western-blot检测显示PSP在48h和72h能明显抑制TAZ磷酸化,阻止了TAZ的降解,而对MST1蛋白表达无影响。结论:(1)去卵巢12周的大鼠体重增加加快、子宫萎缩明显,骨密度和骨量下降明显,骨微结构破坏。(2)PSP在体内能发挥骨质疏松症的防治作用,能阻止去卵巢大鼠的骨密度下降,骨量丢失和骨微结构破坏。(3)PSP在体外促进BMSCs成骨分化时不影响其细胞增殖。(4)PSP能够促进BMSCs成骨分化和矿化并促进成骨分化相关基因(ALP、Runx2、OCN)表达。(5)PSP促进BMSCs成骨分化的机制可能与Hippo信号通路调控相关。
