慢性乙型病毒性肝炎是我国传染性很强的疾病,可导致肝硬化的发生;而肝硬化在中国十大疾病死亡原因中列为第六位,是我国的多发病和常见消化系统疾病。
HBsAg携带者和慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化早期,症状均缺乏特异性,治疗上又无特效药物,因此早期确诊及评估其严重程度,在临床上具有现实意义。
目前随着分子生物学技术的飞速发展,生命科学研究重点已经从结构基因组学转移到蛋白质组学上来。其中表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)是近些年来兴起的一种新的蛋白质组学的研究方法,其具有高通量性及高灵敏度,为研究疾病的发生、发展以及其早期生物标记物的检测,提供了强有力的平台,目前已用于多种疾病的检测和诊断的研究。
本课题旨在利用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱技术(SELDI-TOF-MS)检测慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化、慢性乙型肝炎病毒携带者、及健康者三组人群的血清,得到三组的蛋白质表达谱,分析比较各组差异表达蛋白并构建相应的诊断模型(pattern),以其能从血清中筛选慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化患者和慢性乙型肝炎病毒携带者蛋白质标志物及发现可以用于慢性乙型肝炎病毒携带者和慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化患者诊断的蛋白质组学构型,并为进一步研究提供线索和新的思路。
第一部分蛋白芯片的选择
目的:从CM10、IMAC3-Cu这两种芯片中选择合适应用于慢性乙型肝炎病毒携带者和慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化患者血清蛋白质指纹图谱研究的芯片种类。
方法:选择慢性乙型肝炎病毒携带者、慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化患者和健康人血清各13例,采用CM10、IMAC3-Cu两种蛋白芯片,经SELDI-TOF-MS技术对样本进行检测,得蛋白质质谱扫描谱,并进行比较。
结果:在2000-50000Da范围内,CM10芯片在各实验组捕获的蛋白峰数分别为:慢性乙型肝炎病毒携带者组66个;慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化患者组67个,健康人组69个。IMAC3-Cu芯片在各实验组捕获的蛋白峰数分别为:慢性乙型肝炎病毒携带者组40个;慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化患者组38个,健康人组42。
结论:CMlO能得到更多慢性乙型肝炎病毒携带者、慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化患者和健康人的有显著意义的差异蛋白峰值,能更好应用于本课题的研究。
第二部分慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化患者和慢性乙型肝炎病毒携带者血清蛋白标记物筛选和诊断模型的建立
目的:寻找慢性乙型肝炎病毒携带者和慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化患者相关蛋白质,初步构建慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化患者与健康人诊断模型,慢性乙型肝炎病毒携带者与慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化患者的诊断模型及慢性乙型肝炎病毒携带者和健康人诊断模型,并探讨其临床应用的可行性。
方法:收集26例慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化患者、28例慢性乙型肝炎病毒携带患者,26例健康人新鲜血清,经分析选用Ciphergen公司的CM10芯片(弱阳离子芯片),利用SELDI-TOF-MS技术对样本进行检测,得到其蛋白质质谱扫描谱,并采用Ciphergen Biosystems软件对上述三组波谱进行两两比较分析。
结果:
1、慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化组与健康人组蛋白比较,共检测到69个有效蛋白峰,其中25个蛋白差异有统计学意义(P＜0.05)。与健康人血清蛋白质谱相比,慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化病人血清中有9个蛋白高表达,16个蛋白低表达。利用这6个差异蛋白建立诊断模型,其诊断的灵敏度为73%(19/26),特异度为73%(19/26),准确率73%(38/52)。
2、慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化组与慢性乙型肝炎病毒携带者组比较,共检测到69个有效蛋白峰,其中26个蛋白差异有统计学意义(P＜0.05)。与慢性乙型肝炎病毒携带患者组血清蛋白质谱相比,慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化患者血清中有16个蛋白高表达,10个蛋白低表达。利用这5个差异蛋白建立诊断模型,其诊断的灵敏度为92%(24/26),特异度为86%(24/28),准确率89%(48/54)。
3、健康人组与慢性乙型肝炎病毒携带者组比较,共检测到69个有效蛋白峰,其中28个蛋白差异有统计学意义(P＜0.05)。与健康人血清蛋白质谱相比,慢性乙型肝炎病毒携带者血清中有5个蛋白高表达,23个蛋白低表达。利用这6个差异蛋白建立诊断模型,其诊断的灵敏度为93%(26/28),特异度为77%(20/26),准确率85%(46/54)。
4、发现两个比较有意义的蛋白,质荷比分别为9422.89Da和4656.59Da的蛋白,它们在慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化患者组、在慢性乙型肝炎病毒携带者组、健康人组中表达量呈递增趋势,经统计分析,3组间的差异有统计学意义(P＜0.05)。而7774.40Da、8150.87Da、4604.42Da、9199.05Da、4098.00 Da的蛋白在慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化患者组与慢性乙型肝炎病毒携带者组均低于健康人组(P＜0.05),而在慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化患者组与慢性乙型肝炎病毒携带者组的比较中均无明显差别(P＞0.05),3478.03 Da的蛋白在慢性乙型肝炎病毒携带组与慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化患者组均高于健康人组(P＜0.05),而在慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化患者组与慢性乙型肝炎病毒携带组的比较中无明显统计学差别(P＞0.05)。
结论:
1、慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化患者与慢性乙型肝炎病毒携带者及健康人的血清蛋白组学差异显著,其中的差异蛋白有可能是慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化患者及慢性乙型肝炎病毒携带者相关蛋白。
2、建立的三个诊断模型,能分别将慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化患者血清和健康人血清,慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化患者血清和慢性乙型肝炎病毒携带者血清、慢性乙型肝炎病毒携带者血清和健康人的血清进行分别有效地区分。
3、SELDI-TOF-MS技术,结合生物信息学分析软件,在未来对慢性乙型肝炎病毒携带者和慢性乙型肝炎病毒感染后肝硬化临床诊断和治疗监测上将是一种很有前途的方法。
