促红细胞生成素对新生大鼠缺氧缺血性脑损伤保护作用的研究

目的:新生儿缺氧缺血性脑损伤(hypoxic-ischemic brain damage ,HIBD)是由围生期窒息所引起的,常危及新生儿生命,也是导致儿童神经系统伤残的常见原因之一。近年来研究发现,促红细胞生成素(erythropoietin ,EPO)对缺氧缺血性脑损伤有保护作用,本实验通过建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤(HIBD)模型,腹腔注射外源性重组人促红细胞生成素(recombinant human erythropoietin ,rhEPO),观察新生大鼠HIBD后脑组织病理变化,并观察rhEPO对新生HIBD大鼠脑组织Bcl-2、Bax蛋白表达的影响,探讨EPO对新生大鼠HIBD所产生的保护作用及产生这种保护作用的可能机制,以期为临床治疗新生儿HIBD提供有效的方法。 方法:(1)制备新生大鼠HIBD模型。(2)行为能力的检查:分别于术前和术后及缺氧时观察每只新生大鼠的行为变化。(3)将新生7日龄Wistar大鼠随机分为3组:假手术组,HIBD组,rhEPO治疗组,每组各40只,各组根据处死动物的时间不同随机分为6h、12h、24h、48h、72h,5个亚组,每亚组8只。假手术组给予颈正中切口游离左侧颈总动脉,不进行缺氧缺血,模型组游离并结扎左侧颈总动脉后置于低氧环境中2h,rhEPO治疗组于缺氧缺血后立即一次性腹腔注射重组人促红细胞生成素rhEPO(5000IU/Kg),各组新生大鼠于相应时间点断头取脑组织后肉眼观察脑组织大体形态的改变,石蜡切片行HE染色光镜下观察左侧脑组织病理变化,免疫组织化学方法检测三组大鼠不同时间点左侧脑组织Bcl-2、Bax表达。 结果:(1)缺氧缺血后新生大鼠出现不同程度的行为异常。(2)缺氧缺血后可见脑组织大体有不同程度的异常改变,缺氧缺血后12h左侧脑组织开始出现水肿,24-48h水肿明显,72h可出现坏死灶;rhEPO治疗后上述改变减轻。(3)HE染色:假手术组脑组织结构及细胞层次清晰,神经元排列整齐紧密,仅见个别细胞体积缩小,核深染;HIBD组于术后12h脑组织皮层细胞肿胀,术后24h神经元排列紊乱,细胞间隙增大,可见许多变性的神经元,术后72h出现坏死灶;rhEPO治疗组各时间点损伤程度较HIBD组明显减轻,神经细胞存活数量多,细胞排列尚规则,少量神经细胞变性坏死,多数海马区神经细胞形态正常,可见正常锥体细胞。(4)免疫组织化学染色:①Bcl-2的表达,Bcl-2阳性染色呈棕黄色的细颗粒沉积,阳性细胞广泛表达于大脑皮层和海马,阳性着色主要位于神经元胞浆内,在假手术组呈低水平表达,各时间点比较差异无统计学意义(P>0.05);HIBD组各时间点Bcl-2阳性颗粒染色较假手术组深,数量多,阳性细胞平均灰度值较假手术组低,差异均有统计学意义(P<0.01);rhEPO治疗组各时间点Bcl-2阳性颗粒染色较HIBD组染色深,数量明显增加,阳性细胞平均灰度值较HIBD组低,差异均有统计学意义(P<0.01);HIBD组和rhEPO治疗组Bcl-2阳性产物表达高峰均在术后24h。②Bax表达:Bax阳性染色呈棕黄色细颗粒沉积,阳性细胞广泛表达于大脑皮层和海马,阳性着色主要位于神经元胞浆内,Bax蛋白假手术组中少量表达;HIBD组各时间点Bax阳性颗粒最多,染色最深,各时间点阳性细胞平均灰度值表达较假手术组和rhEPO治疗组低,差异均有统计学意义(P<0.01);rhEPO治疗组各时间点Bax表达较假手术组多,阳性细胞平均灰度值表达较假手术组低,差异均有统计学意义(P<0.01);HIBD组和rhEPO治疗组Bax阳性产物表达高峰均在术后24h。③Bcl-2和Bax蛋白两者比值的变化:Bcl-2/Bax在HIBD后比值降低,rhEPO治疗后比值增加,各组间比较均有显著性差异(P<0.01)。 结论:(1)通过对缺氧缺血后新生大鼠行为能力的观察以及大鼠脑组织病理学观察,证实新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型建立成功,并且rhEPO治疗后可减轻缺氧缺血所致的脑损伤。(2)rhEPO可能通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,下调促凋亡蛋白Bax表达,改变Bcl-2/ Bax的比值,减轻HIBD病理损伤过程,抑制神经细胞凋亡,从而对缺氧缺血引起的神经细胞损伤起到一定的保护作用,进一步为临床治疗新生儿缺氧缺血性脑损伤提供新的治疗思路。