JAK/STAT3对大鼠重症急性胰腺炎血清体外作用AT-Ⅱ损伤的作用机制研究

研究背景和目的:重症急性胰腺炎（severe acute pancreatitis,SAP）发病及其凶险,死亡率超过30%,在发病早期内死亡者多由于急性胰腺炎相关肺损伤（acute pancreatitis associated lung injury,APALI） （1,2）。其发病机制复杂,目前研究显示APALI是多因素共同作用下的病理生理过程,首先是胰酶的激活导致局部细胞因子（包括核因子）的活化,并使局部白细胞活化并释放大量的细胞因子和炎症介质损伤局部组织,其次,血浆细胞因子剧增扩大炎症反应,继而导致远隔脏器白细胞聚集、激活,再通过白细胞的呼吸爆发,释放氧自由基损伤远隔脏器。细胞因子等炎症介质为其核心机制和直接因素。近年来,随着对不同刺激因素导致急性肺损伤的研究日益加深,发现炎症反应的激活主要是通过细胞内多条信号转导通路实现的,并发现JAK激酶/信号转导-转录活化因子3（Janus kinase/ signal transducers and activators of transcription,JAK/STAT3）通路是其中最为普遍、重要且共同的通路;当JAK/STAT3磷酸化后,进一步激活核因子和蛋白等,并启动和调控细胞因子和炎症介质的基因转录,大多数细胞因子经此通路将信号由细胞膜最终传至胞核,以发挥多种生物学效应,进而启动一系列炎症性病理过程（3, 4）。鉴于这些研究结果高度提示此信号转导通路是炎症反应启动的“总开关”,有效调节该关键的信号通路,便可在炎症反应的早期遏制其瀑布式放大,防止急性肺损伤的发生。 基于此,本实验中我们用胰腺被膜下注射5%牛黄胆酸钠制作SD大鼠重症急性胰腺炎模型,改良的体外培养法原代培养肺泡Ⅱ型上皮细胞,用SAP大鼠血清体外作用AT-Ⅱ,并用JAK激酶抑制剂AG490预处理,采用EMSA法、RT-PCR法、Western blotting法分别检测AT-ⅡSTAT3 DNA结合活性、mRNA和蛋白表达,同时行AT-Ⅱ的SP-C、凋亡、Na+-K+-ATPase检测,探讨JAK/STAT3通路在重症急性胰腺炎肺损伤发病过程中的作用,以期能为早期干预重症急性胰腺炎肺损伤提供新的思路。 研究方法: 1.用胰腺被膜下注射5%牛黄胆酸钠制作SD大鼠重症急性胰腺炎模型; 2.改良的体外培养法原代培养肺泡Ⅱ型上皮细胞; 3.实验分组: 1)对照组:加入不含大鼠胰腺炎血清的DMEM培养液的正常AT-Ⅱ; 2) SAP组:加入终浓度为10%大鼠胰腺炎血清的DMEM培养液的正常AT-Ⅱ; 3) SAP+AG490组:用AG490（JAK激酶抑制剂） (终浓度为10umol/L（5）)预处理细胞6小时后,加入终浓度为10%大鼠胰腺炎血清。 4.采用EMSA法、RT-PCR法、Westernblotting法分别检测各组AT-Ⅱ的STAT3 DNA结合活性、mRNA和蛋白表达; 5.采用流式细胞技术检测各组AT-Ⅱ的SP-C、凋亡检测,比色法检测Na+-K+-ATPase活性。 结果 1. SAP组24小时后胃肠管胀气、坏死,大部分大鼠可见血性腹水、胸水,胰腺充血、水肿明显,可见坏死灶,胰周有皂化斑;镜下见胰腺组织间质明显水肿,叶间隔、小叶间隔甚至腺泡间隔距离增宽,血管扩张充血,局部可见出血灶,散在多发的局灶性坏死,伴有大量的炎性细胞浸润。 2.培养2d的AT-Ⅱ（AKP染色）胞浆中有较多分布不均,大小不一的蓝色颗粒;培养5d的AT-Ⅱ（鞣酸染色）可见不均匀地分布在核周的大小不一的褐色的嗜锇小体（板层小体）,细胞聚集成小岛状。 3.大鼠重症胰腺炎血清作用2h后,与对照组比,SAP组STAT3 DNA活性增强;与SAP组比,SAP+AG490组STAT3 DNA活性减弱;与对照组（36.532）比,SAP组STAT3mRNA （46.824）表达增强（P<0.01） ;与SAP组比, SAP+AG490组STAT3mRNA（21.116）表达减弱（P<0.01）;与对照组比,SAP组STAT3蛋白表达增强;与SAP组比,SAP+AG490组STAT3蛋白表达减弱。 4.大鼠重症胰腺炎血清作用4h后,与对照组比,SAP组SP-C蛋白表达下降（P<0.01）,与SAP组比,SAP+AG490组SP-C蛋白表达下降C（P < 0.01）。大鼠重症胰腺炎血清作用2h后,与对照组比,SAP组AT-Ⅱ凋亡增加（P<0.05）;与SAP组比,SAP+AG490组AT-Ⅱ凋亡增加（P<0.05）。大鼠重症胰腺炎血清作用2h、4h后,与对照组比,大鼠重症胰腺炎血清作用2h、4h后SAP组Na+-K+-ATPase活性减弱（P <0.05）;与SAP组比, SAP+AG490组Na+-K+-ATPase活性减弱（P <0.05）。 结论 1.胰腺被膜下注射牛黄胆酸钠制作SD大鼠重症急性胰腺炎模型制作成功,这种制模方法可靠,操作简单,重复性好,适于大量成批动物模型制备,为探讨SAP发病机制研究提供实验动物模型。 2.改良的体外AT-Ⅱ细胞培养成功,其较改良前方法较简单,培养细胞浓度提高,为体外实验提供较好的细胞来源。 3. JAK/STAT3通路在急性胰腺炎相关肺损伤中得到激活,其参与了急性胰腺炎相关肺损伤的发病的病理生理过程。JAK激酶抑制剂AG490在体外可有效抑制AT-Ⅱ中JAK/STAT3通路。 4.在急性胰腺炎相关肺损伤的发病过程中,JAK/STAT3通路可能具有维持分泌SP-C、抑制细胞凋亡、维持钠-钾-ATP酶的活性,保持肺泡稳定性的作用。