印楝油体外杀螨活性及其活性物质的分离纯化与结构鉴定研究

印楝油（neem oil）是印度传统药用植物—印楝树（Azadirachta indica A.Juss）的种子提取物,具有抗寄生虫、抗微生物、解热镇痛、抗炎、免疫调节、抗溃疡和促进伤口愈合等药理活性。近年来关于印楝油抗动物体表寄生虫活性的研究主要集中在牛寄生蜱,对疥螨的生物活性研究较少。为了开发新型植物源杀螨剂和充分利用我国丰富的印楝资源。本研究探讨了印楝油对兔疥螨（Sarcoptes scabiei var.cuniculi）的体外杀螨活性,在此基础上,采取生物活性追踪法对印楝油进行了活性部位的筛选研究和活性物质的分离纯化及结构鉴定。主要研究结果如下: 1.印楝油对兔疥螨幼虫的离体杀螨活性研究:采用平皿法观察了在相对湿度（Relativehumidity,R.H）为75%R.H时,不同温度和介质对兔疥螨幼虫体外存活率的影响。结果表明,在相对湿度为75%R.H,温度为25℃,介质为液体石蜡或花生油的条件下,兔疥螨幼虫体外存活率高,24h存活率在90%以上。该条件可作为离体杀螨试验的环境条件。 采用浸杀方式观察了印楝油对兔疥螨幼虫的离体杀螨活性。结果表明,未稀释的印楝油在25.00 min内杀死所有供试螨虫,杀螨活性显著强于浓度为500 mg/mL的天然除虫菊酯（825.00min,P＜0.01）,与浓度为25 mg/mL的阿维菌素相当（18.75 min,P＞0.05）;印楝油在24h半数致死浓度为2.908μL/mL:浓度为500、250和125μL/mL的印楝油对兔疥螨幼虫半数致死时间分别为0.991、2.176和5.33h,其杀螨活性表现出浓度-时间依赖性。可见印楝油对兔疥螨幼虫具有显著的离体杀螨活性。 2.印楝油杀螨活性部位的筛选:采用系统溶剂法对印楝油进行提取分离,并通过离体杀螨试验筛选活性部位。结果表明,印楝油石油醚、氯仿和乙酸乙酯提取部位得率分别为56.82%、25.36%和5.14%。浓度为250μL/mL时,三种提取物的杀螨活性在作用前期（12h）和后期（20h）无显著差异;在作用中期（16h）,三者的致死率分别为95.15%、80.28%、83.65%,表现为:石油醚提取物杀螨活性显著强于氯仿和乙酸乙酯提取物（P＜0.05）,而氯仿提取物和乙酸乙酯提取物两者差异不显著。可见印楝油石油醚、氯仿和乙酸乙酯提取部位都具有较强的杀螨活性,其中石油醚提取部位杀螨活性相对较高,氯仿和乙酸乙酯提取部位杀螨活性相近。 3.印楝油杀螨活性物质的跟踪分离与纯化:采用硅胶柱层析法、重结晶纯化技术,结合离体杀螨试验对印楝油石油醚和氯仿提取物杀螨活性物质进行跟踪分离与纯化。结果表明印楝油石油醚和氯仿提取物均得四个段位,其中氯仿提取物的段位Ⅲ杀螨活性突出,在浓度为200 mg/mL时,4.5h内可杀死所有供试螨虫;对段位Ⅲ用丙酮反复重结晶后得—白色雪花状结晶物。可见印楝油杀螨活性物质主要集中在氯仿提取物的段位Ⅲ中,并从中获得一种结晶化合物。 4.单体化合物杀螨活性的测定:采用互补重对数模型拟合印楝油单体化合物的离体杀螨毒力。结果表明,印楝油单体化合物杀螨毒力表现出浓度效应是时间的相关函数,时间效应又是浓度的相关函数,24h的半数致死浓度为0.082 mg/mL,仅为印楝油的1/33,7.500 mg/mL浓度时的半数致死时间为15.33 h。可见该单体化合物具有很强的离体杀螨活性。 5.单体化合物的波谱分析:采用红外波谱、电喷雾电离质谱、1H核磁共振、13C核磁共振、无畸变极化转移增益实验及二维核磁共振谱等波谱学分析对印楝油单体化合物进行结构解析。结果表明,电喷雾电离质谱（[M]+,m/z）:636;分子式C40H76O5;红外(cm-1):2917.40,2849.33,1471.44,1381.38,717.67（饱和烷基）,1735.84,1182.08,1256.82（—CO—O—）,1139（—O—）;1H核磁共振（CDCl3,400 HZ,δ/ppm）.0.86（—CH3）,1.25、1.63、2.35（—CH2—）,4.15为甲氧基上的亚甲基和次甲基氢（—CH2—,—CH—）;13C核磁共振（CDCl3,400 HZ,δ/ppm）:173.89为羰基碳,68.45为呋喃环上次甲基碳,δ65.05为呋喃环上亚甲基碳,14.09为甲基碳,22.68、24.90、29.13、31.92、34.11均为亚甲基碳;1H-1H二维化学位移相关谱:δH 0.86与δH 1.25偶合相关,δH 1.25与δH 1.63偶合相关,δH 1.63与δH 2.35偶合相关;1H异核多量子相干谱:δC 14.09与δH 0.86相关,δC 22.68,29.13,31.92与δH 1.25相关,δC 24.90与δH 1.63相关,δC 34.11与δH2.35相关,δC 65.05,68.45与δH 4.15相关;1H异核多键相关谱:δH 0.86与δC 22.68、31.92远程相关,δH 1.25与δC31.92、24.92远程相关,δH 1.63与δC 34.11、29.13,δH 4.15与δC 68.45、65.05远程相关。该化合物被鉴定为十八-碳酸-四氢呋喃-3,4二酯（Octadecanoicacid-tetrahydrofuran-3,4-diyl ester）。