中草药以多成分作为物质基础发挥药效作用,多成分的快速、准确、灵敏的分析检测技术和方法是中草药成分分析和质量评价的有力手段。
RRLC（Rapid Resolution Liquid Chromatography）为一种新型的高分离度快速液相色谱技术,具有高分离度、高灵敏度和快速的特点,在复杂基质及多成分分析研究中体现出了较大的优势。本文第一部分采用RRLC分析技术,研究建立了2种常用中草药指纹图谱及主要成分定量测定的分析方法。
乌头类药材在中国和一些东亚国家的民间用药中应用十分广泛。目前因服用乌头类药材而导致的中毒事件仍频繁发生。双酯型生物碱,如新乌头碱、乌头碱、次乌头碱等是乌头类药材中的剧毒成分,同时也是药效成分,该类成分的治疗窗很窄。如何快速、准确的评价和控制乌头类药材的质量,对于其安全用药至关重要。在第一部分的第二章,研究和建立RRLC方法用于乌头类药材的指纹图谱分析,并采用此方法同时测定各乌头药材中新乌头碱、乌头碱、次乌头碱的含量。该方法分析条件为:Zorbax Extend C18色谱柱,流动相组成为甲醇-0.26%醋酸氨体系,梯度洗脱,RRLC方法分析每个样品的时间仅需10 min,比传统的HPLC方法的分析时间缩短了约6倍。采用RRLC-DAD/MS技术对乌头类药材指纹图谱中的11个主要成分进行了指认。新乌头碱的线性范围为4.93-492.50μg/mL,乌头碱的线性范围为5.18-517.50μg/mL,次乌头碱的线性范围为4.93-492.50μg/mL;四种生物碱的日内精密度的RSD在0.80-1.91%之间,日间精密度的RSD在0.19-4.93%之间;重复性的RSD小于2.19%;日内及日间稳定性的RSD分别小于3.23%、3.08%;回收率在98.37-101.50%之间,符合对上述三个生物碱的定量分析要求。因此,本文所建立的RRLC方法准确、快速、简便,既可以对大批量的乌头类药材进行常规的多成分指纹图谱分析,又可以同时对主要成分进行定量分析,为乌头类药材的质量评价提供参考信息。
黄连为常用中药,传统的种植方式采用砍林搭建人工棚遮荫栽培黄连,消耗的木材量大,造成森林毁坏、水土流失;目前已经逐渐采用生态技术栽培黄连,包括林药间作、药药间作、粮药间作等生态技术新模式,提高了经济效益,也保护了生态环境。在第一部分的第三章,应用RRLC技术,研究和建立了灵敏度高、专属性好的RRLC-UV方法,用于评价不同种植条件、不同产地、不同炮制方法得到的黄连样品的质量,该方法不仅对四个主要生物碱（药根碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱）进行含量测定,还能够同时进行黄连中多成分的指纹图谱分析。该方法分析条件为:Zorbax Eclipse Plus C8色谱柱,流动相组成为乙腈-20 mmol/L KH2PO4体系,梯度洗脱,每个样品的分析时间仅需3.5 min,比传统的HPLC方法的分析时间缩短了近7倍。药根碱的线性范围为4.75-47.50μg/mL,黄连碱的线性范围为20.60-164.80μg/mL,巴马汀的线性范围为18.07-180.73μg/mL,小檗碱的线性范围为89.70-717.57μg/mL;4种生物碱的日内及日间精密度的RSD分别在0.4-1.5%及0.3-3.7%之间;重复性的RSD在0.6-1.2%之间;日内及日间稳定性RSD分别在0.4-0.5%及0.4-1.3%之间;回收率在96.30-104.10%之间,RSD小于3.3%,符合对上述四个生物碱的定量分析要求。药根碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱的最低检测限分别为0.19 ng、0.21ng、0.15 ng、0.14 ng,最低定量限分别为57 ng,0.82 ng,0.55 ng,and 0.27 ng。方法准确、快速、简便,适用于黄连药材的日常质量控制。
中药中的寡糖和多糖的药效作用越来越受到关注,寡糖分子量分布及多糖的单糖组成研究是评价其质量、提供理化性质和结构基本信息的重要内容,在本论文的第二部分第一章建立了毛细管凝胶电泳-激光诱导荧光法分析测定了疏血通注射液糖蛋白中N-连接寡糖链的分子量分布。首先用肽糖苷酶F（PNgase-F）释放出疏血通糖蛋白中N-端连接的寡糖,采用荧光试剂APTS标记后,以毛细管凝胶电泳-激光诱导荧光检测法（HPCE-LIF）分离和检测寡糖衍生物。分析条件为:eCAPTMN-CHO中性涂层毛细管柱,分离介质为糖分离凝胶缓冲液,翻转电极,负极压力进样,正极检测,采用LIF检测器,激发波长488 nm,接收波长520 nm。寡糖衍生物按分子量由小到大的顺序出峰,通过与1-20个聚合度的葡聚糖衍生物电泳梯度图谱的比较,测得疏血通糖蛋白中N-连接寡糖链单糖、二聚葡萄糖、三聚葡萄糖、四聚葡萄糖。该方法是一种分析寡糖分子量分布的准确、有效的方法。
第二部分第二章建立了一种1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）柱前衍生化HPLC同时测定5种中性糖（葡萄糖、甘露糖、半乳糖、鼠李糖、木糖）、2种糖醛酸（葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸）的方法。PMP衍生物不易裂解,没有立体异构体,没有副产物产生。分析条件:采用常规的C18色谱柱,梯度洗脱,DAD检测器240nm波长检测,几种单糖的PMP衍生物得到了很好的分离。用此方法对人工栽培的蛹虫草中多糖的单糖组成进行了分析。结果表明:本方法特异性好、简单、快速、准确、方便,可进一步推广应用于其他中草药多糖的单糖组成分析。
