淫羊藿苷在促大鼠MSCs骨向分化过程中对Notch信号通路的影响

目的： 观察淫羊藿苷（ICA）促离体培养大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）增殖、骨向分化能力，研究Notch信号通路在MSCs向成骨细胞（OB）分化过程的作用。 方法： 1、全骨髓贴壁法分离培养3月龄SD大鼠MSCs，通过观察细胞形态、检测细胞表面标志物、诱导骨向分化相结合鉴定MSCs。 2、MTT检测ICA对MSCs增殖能力的影响；pNPP和ELISA检测ICA对MSCs碱性磷酸酶（ALP）、I型胶原（ColI）和骨钙素（BGP）合成分泌的影响，实验中采用10-8Μ雌二醇（E2）作为阳性对照。 3、pNPP和ELISA检测10μΜγ分泌酶抑制剂（DAPT）预处理30min后ICA对MSCs合成分泌ALP、ColI和BGP的影响。 4、QPCR检测ICA对MSCs过氧化物酶体增殖剂激活受体γ（PPARγ）、CCAAT/增强子结合蛋白α（C/EBPα）、脂肪酸结合蛋白4（FABP4）mRNA表达的影响。 5、Western-blot检测ICA对MSCsNotch1受体、转录因子CBF1蛋白表达的影响，评价Notch信号通路在ICA促MSCs向OB分化过程中的作用。 结果： 1、流式细胞仪检测分离到的大鼠MSCs表面标志抗原CD29表达阳性，CD45及CD34表达阴性；倒置相差显微镜、扫描电子显微镜观察细胞形态，均符合MSCs的生物学特性。 2、经MTT法检测ICA在10-4M～10-8M浓度范围内促MSCs增殖作用，发现10-5MICA组的OD值较其它组明显提高（P<0.05），并能显著提高MSCsALP的表达（P<0.05）。根据上述实验结果选取10-6M、3×10-6M、10-5M进一步筛选ICA最佳促骨向分化浓度，结果表明，3×10-6MICA能显著提高MSCsALP、ColI和BGP的表达（P<0.05），后续实验选取3×10-6MICA作为干预浓度。 3、实验观察了3×10-6MICA对低、中、高密度MSCsALP表达的差异，实验结果表明低密度MSCs较中、高密度MSCsALP表达量明显提高（P<0.05），间接说明了需要相邻细胞间配体与受体相互作用激活的Notch信号通路可能发挥抑制成骨分化作用。 4、ICA能够下调脂向分化转录因子C/EBPα、PPARγ、FABP4mRNA的表达（P<0.05），下调Notch信号转录因子CBF1蛋白的表达（P<0.05），但对Notch1蛋白的表达不起作用（P>0.05）。 5、DAPT能够下调CBF1、Notch1蛋白的表达（P<0.05），上调C/EBPα、FABP4mRNA的表达（P<0.05），但对PPARγmRNA的表达不起作用（P>0.05）。 6、ICA与DAPT联合作用能够下调CBF1、Notch1的表达（P<0.05），上调C/EBPα、PPARγ、FABP4mRNA的表达（P<0.05）。 结论： 1、ICA能够促进MSCs骨向分化，抑制脂向分化转录因子C/EBPα、PPARγ、FABP4mRNA的表达，且能通过下调Notch信号核心结合蛋白CBF1的表达抑制Notch信号通路。 2、Notch信号通路在ICA促MSCs向OB分化过程中发挥抑制成骨作用。 3、应用DAPT阻断Notch信号通路能促进脂向分化转录因子C/EBPα、FABP4mRNA表达，抑制成骨分化。 4、ICA与DAPT相互作用后可激活Notch1的表达，且通过上调C/EBPα、PPARγ、FABP4mRNA的表达抑制成骨分化。