RGD-蛛丝蛋白/聚己内酯/壳聚糖小直径血管支架的细胞相容性及应用于血管缺损修复

血管移植是治疗动脉硬化等疾病的主要手段,通常选用自体大隐静脉或内乳动脉作为材料,但可供移植的自体血管数量有限,且一些患者不适合进行自体血管移植。人工合成血管如聚四氟乙烯和涤纶在大中直径(内径>6mm)血管移植中已获成功,但在小直径(内径<6rmm)血管移植中因其低血流量和高剪切力,易导致血栓形成及内膜增生,远期通畅率不够理想,且由于缺乏降解性及促组织再生能力,长期移植存在生物相容性差等问题。近年来,组织工程学的发展为研究可降解、生物相容性良好的小直径血管支架提供了新途径。 本室前期将RGD-蛛丝蛋白(命名为pNSR32)与力学性能优良的聚已内酯(PCL)、血液相容性良好的壳聚糖(CS)共混,应用静电纺丝技术制备pNSR32/PCL/CS小直径血管支架。实验结果观察到该血管支架具有良好的血液相容性,恰当的力学性能,其三维多孔网状结构模拟了细胞外基质的结构。本研究在此基础上,探讨该血管支架的生物降解性；以SD大鼠胸主动脉内皮细胞(SDRAECs)为种子细胞,从细胞的粘附、增殖、细胞周期、骨架蛋白发育、表型表达、活性物质分泌等方面对支架的细胞相容性进行较为全面的评价；构建SD大鼠腹主动脉缺损模型,应用“双袖套法”,以血管支架桥接缺损,观察小直径血管支架应用于体内的稳定及通畅情况。 实验结果如下： 一、研究小直径血管支架的生物降解性能。随着降解时间的延长,pNSR32/PCL/CS复合支架材料各组的失重率均不断升高,降解程度依次为体内降解组>体外酶解组>体外水解组。将pNSR32、CS与PCL共混在一定程度上能够促进PCL的降解,缓解因PCL降解而引起的周围环境酸性过大的现象。证明pNSR32/PCL/CS复合血管支架具有生物可降解性。 二、探讨小直径血管支架的细胞相容性。分别从细胞毒性、粘附增殖以及功能发挥三个方面对其进行研究。 1、考察小直径血管支架的细胞毒性。应用组织块法,可获得高纯度的SDRAECs.MTT法检测结果显示PCL、pNSR32/PCL及pNSR32/PCL/CS三种血管支架浸提液均不显示细胞毒性,符合组织工程支架材料的应用要求。细胞相对增殖度的大小为pNSR32/PCL/CS组>pNSR32/PCL组>PCL组,表明pNSR32和CS对PCL支架的细胞相容性具有良好的改善效果。单细胞凝胶电泳实验结果显示,培养于pNSR32/PCL/CS小直径血管支架浸提液中的细胞未见DNA损伤,提示pNSR32/PCL/CS无明显遗传毒性,为进一步开展动物体内研究奠定了基础。 2、分析小直径血管支架对内皮细胞粘附和增殖的影响。SDRAECs与三种支架复合培养,实验结果显示pNSR32和CS的添加能够改善支架的细胞相容性。具体结果如下：细胞粘附实验说明与pNSR32/PCL/CS支架复合培养的SDRAECs粘附能力最强,细胞骨架蛋白发育最好。扫描电镜观察结果显示pNSR32/PCL/CS上生长的细胞能够保持良好的生长形态,并分泌基质。细胞增殖实验表明pNSR32/PCL/CS能够促进SDRAECs的生长,细胞数量多于pNSR32/PCL和PCL组。流式细胞术结果表明pNSR32/PCL/CS小直径血管支架促进细胞DNA合成及增殖是通过促使细胞从Go/G1期向S期转化实现的。同时,细胞DI值在1.0±0.1范围内,表明pNSR32/PCL/CS支架无致癌性,可应用于体内。 3、尝试从细胞功能发挥方面对小直径血管支架的细胞相容性进行研究。硝酸还原酶法测定一氧化氮(NO)分泌实验表明,pNSR32/PCL/CS小直径血管支架能促进SDRAECs释放血管活性物质NO,分泌量大于pNSR32/PCL组和PCL组,与TCP对照组相比差异具有统计学意义(3、5、7d,P<0.05)。细胞免疫荧光结果显示pNSR32/PCL/CS小直径血管支架支持SDRAECs强烈表达内皮细胞标志物——vWF. PECAM-1,其细胞生物学特性未受影响。可见,pNSR32/PCL/CS小直径血管支架能够初步形成具有“生理功能”的组织工程化血管。 三、探讨pNSR32/PCL/CS小直径血管支架在临床应用上的可行性。构建SD大鼠腹主动脉缺损模型,应用“双袖套法”,以pNSR32/PCL/CS小直径血管支架桥接缺损。在移植手术期间,pNSR32/PCL/CS小直径血管支架显示出良好的可操作性,术后动物恢复良好,活动以及进食等行为均保持正常。血液生理生化结果显示该支架对机体肝肾功能无明显影响。支架在体内正常血流环境下能够支持细胞生长,并至少能够维持8周结构完整和通畅,但移植支架的长期稳定及通畅性并不清楚。