苦参碱诱导的自噬在原发性肝癌中的作用

背景：苦参碱是中药苦参中提取的主要有效活性物质,研究显示它具有一定的抗肿瘤作用,然而其具体的机制不清。 目的：探讨苦参碱诱导肝癌细胞和肝卵圆细胞的自噬现象及分子机制。 第一部分苦参碱诱导肝卵圆细胞的自噬现象及机制研究 材料和方法：不同浓度苦参碱作用于大鼠肝卵圆细胞系WB-F344,构建体外模型。应用流式细胞术检测细胞的凋亡；应用MDC染色荧光定位法、LC3Ⅱ/Ⅰ免疫印迹法(Western blotting)和电镜法检测细胞的自噬；应用PCR和免疫印迹法探讨苦参碱诱导自噬的分子机制。 结果：10.4mg/ml和0.8mg/ml苦参碱作用于肝卵圆细胞WB-F344后,MDC阳性细胞数和自噬特异标记分子LC3Ⅱ水平显著增加,说明一定浓度的苦参碱诱导肝卵圆细胞自噬产生,电镜进一步确证自噬体的诱导。2.0.4mg/ml和0.8mg/ml苦参碱显著诱导卵圆细胞凋亡产生,呈浓度依赖性,RT-PCR观察到0.4mg/ml和0.8mg/ml苦参碱作用后,凋亡标记分子BCL-2mRNA水平下降,BAX mRNA水平增加,从而导致BCL-2/BAX mRNA比例显著下降,说明一定浓度的苦参碱能同时诱导肝卵圆细胞凋亡产生,与BCL-2、BAX分子表达变化相关。3.0.8mg/ml苦参碱联合自噬特异抑制剂3-MA (3-methyladenine,三甲基腺嘌呤)后,细胞凋亡显著增加。4.与对照细胞相比,0.8mg/ml苦参碱作用于肝卵圆细胞后,β-catenin蛋白表达水平显著下降；过表达和特异激动剂异常激活β-catenin蛋白导致自噬特异标记分子LC3Ⅱ水平和凋亡标记分子BCL-2/BAX mRNA比例显著升高；然而RNA干扰技术(RNAi)特异抑制β-catenin蛋白后,LC3Ⅱ水平和BCL-2/BAX mRNA比例降低,提示β-catenin蛋白参与苦参碱诱导的自噬和凋亡；5.自噬特异激动剂Rapamycin诱导β-catenin蛋白表达下降,而苦参碱联合自噬特异抑制剂3-MA后,下降的β-catenin蛋白水平反而增加,提示自噬体参与β-catenin蛋白水平的调节。 结论：一定浓度苦参碱可诱导肝卵圆细胞自噬和凋亡增加,而抑制自噬后细胞凋亡显著增加。β-catenin蛋白参与苦参碱诱导的自噬与凋亡,而自噬增加时反馈抑制β-catenin蛋白,β-catenin分子可能是自噬和凋亡相互转变的桥梁。 第二部分苦参碱诱导肝癌细胞的自噬现象及机制研究 材料和方法：不同浓度苦参碱作用于人肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721,构建体外模型。应用MDC染色法、GFP-LC3荧光定位法、LC3Ⅱ/Ⅰ免疫印迹法和电镜法检测细胞的自噬；应用基因芯片和免疫印迹法探讨苦参碱诱导自噬的分子机制。 结果：1.不同浓度苦参碱作用于HepG2和SMMC-7721细胞,诱导细胞自噬和凋亡的产生,抑制自噬可使细胞凋亡显著增加。2.在HepG2细胞系中,自噬呈非mTOR依赖的途径,而在SMMC-7721细胞系中,自噬呈mTOR依赖的途径。3.苦参碱作用于HepG2细胞系中,我们观察到苦参碱诱导的自噬涉及p53/AMPK信号通路,而抑制AMPK活性,细胞凋亡显著增加。4.我们发现p53异构体(p53β、 p53y、△133p53和△133p53γ)与苦参碱诱导的自噬相关。5.利用基因芯片探讨苦参碱的分子机制,我们发现干扰素α诱导蛋白27(IFI27)和干扰素诱导跨膜蛋白1(IFITM1)涉及苦参碱诱导的自噬,并且受p53调节。 结论：一定浓度的苦参碱可促进肝癌细胞自噬,苦参碱诱导的自噬可抑制肿瘤细胞凋亡；p53/AMPK、p53/IFN通路及p53异构体参与苦参碱诱导的自噬。