1、第一部分 单核细胞亚群在原发免疫性血小板减少症中的分布及功能研究 2、第二部分 IL-35在原发免疫性血小板减少症中的表达及其临床意义

研究背景：单核细胞是一群极具异质性的细胞,在固有免疫、炎症和自身免疫反应中发挥着重要的作用。1989年,在二色法流式细胞术基础上,一种新的CD16+单核细胞被首次报道。这一群CD16+单核细胞比常规的单核细胞(经典型)有更强的分泌促炎因子能力和抗原递呈能力,因而被认为是一类“促炎单核细胞”,在细菌或病毒感染、炎症性疾病和多种自身免疫性疾病如类风湿性关节炎、克隆氏病中均出现明显扩增。近年来,越来越多的证据支持将这群CD16+单核细胞依据不同的表型和功能进一步细分为：中间型(CD14++CD16+)和非经典型(CD14+CD16++)单核细胞两个亚群。原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia,ITP)作为一种自身免疫性疾病,存在多种复杂的免疫缺陷,单核细胞亚群在ITP中的分布情况及在发病机制中的作用尚待深入阐明。 目的：研究在ITP病人中,单核细胞亚群的分布情况,并探讨其在ITP发病中的作用机制。 方法：采集外周血,流式细胞术检测71例未治疗活动期ITP患者、(?)3例正在应用糖皮质激素治疗患者和49例健康对照外周血单核细胞亚群的分布情况,分析单核细胞亚群的分布与血小板数之间的关系,ELISA法检测血浆中主要由单核细胞分泌的细胞因子水平。用流式细胞分选技术分选出经典型、中间型、非经典型三个单核细胞亚群,ELISA法分别检测体外不同亚群在LPS刺激下的分泌细胞因子的能力。将分选出的不同单核细胞亚群分别与CD4+T细胞和自体血小板共培养,Brdu ELISA检测各亚群对血小板特异性自身反应性T细胞增殖的作用,并通过ELISA检测共培养上清IFN-γ水平了解其对于Th1细胞分化的影响。 结果：结果显示,未治疗的活动期ITP患者非经典型单核细胞出现显著扩增(ITP：5.44%[0.36%-22.29%] vs Ctrl：1.83%[0.12%-7.11%],p<0.001),中间型单核细胞的比例也明显增加(ITP：10.54%[5.01%-45.15%] vs Ctrl：7.6%[1.6%-23.99%],p<0.001),经典型单核细胞比例明显减少(ITP：82.6%[51.23%-92.38%] vs Ctrl：90.75%[66.83%-95.92%],p=0.001)。并且,中间型和非经典型单核细胞与血小板数呈负相关,而经典型单核细胞与血小板数呈正相关。其中9例患者在病情完全缓解后再次检测,非经典单核细胞亚群的比例明显下降(未治疗：7.47%[0.57%-11.85%]vs完全缓解：1.16%[0-8.78%],p=0.015),而中间型和经典型单核细胞比例无明显变化。在(?)例正在应用糖皮质激素治疗患者,非经典型单核细胞较未治疗组显著减少(p<0.001),经典型单核细胞比例恢复至接近正常对照水平。活动期ITP患者的中间型单核细胞分泌的TNF-α水平较经典型单核细胞(p=0.049)和非经典型单核细胞(p=0.007)明显升高。同样,活动期ITP患者的中间型单核细胞分泌的IL-1β水平较经典型单核细胞(p=0.028)和非经典型单核细胞(p=0.023)明显升高。经过体外共培养,非经典型单核细胞较中间型单核细胞显示出更强的促进自身反应性T细胞增殖的能力,但差异未达到统计学意义(p=0.066)。还检测了单核细胞亚群与自体CD4+T细胞和血小板共培养上清的IFN-γ水平,发现非经典型单核细胞比中间型单核细胞更能促进T细胞分泌IFN-γ(p=0.047)。 结论：由此我们可以得出结论,中间型和非经典型单核细胞在ITP患者中出现明显扩增,糖皮质激素治疗可以迅速逆转非经典型单核细胞的扩增。中间型单核细胞具有更强的细胞因子分泌能力,非经典型单核细胞能够促进自身反应性T细胞增殖以及Thl细胞的分化,从而对ITP的发病起到重要的作用。 研究背景：原发免疫性血小板减少症(primary immune thorombocytopenia, ITP)是一种以血小板减少,皮肤黏膜出血为主要表现的自身免疫性疾病,发病机制复杂。IL-35是近年新发现的一种具有抗炎作用的细胞因子,是IL-12家族的新成员,由P35和EBIB两个亚基组成。研究显示,IL-35主要由活化的调节性T细胞分泌,可以抑制CD4+效应T细胞从而减轻炎症和自身免疫反应,并且,IL-35可以通过“传染性耐受”将传统T细胞转化为能够进一步分泌IL-35的诱导型调节性T细胞。但是,关于IL-35的研究多在健康人及实验动物中进行,其在ITP中的作用研究尚待进一步阐明。 方法：用ELISA方法检测36例活动期ITP患者和20例缓解期ITP患者血浆中IL-35,TGF-β1和IL-10的水平,以30例健康人作为对照。进一步分析IL-35水平与ITP患者各临床参数之间的关系。用实时定量PCR的方法检测患者和健康对照外周血单个核细胞中IL-35两个亚基P35和EBI3mRNA的表达水平。 结果：通过ELISA检测,我们发现活动期ITP患者血浆中IL-35的水平较缓解期ITP患者(p=0.017)及健康对照(p<0.001)显著降低,并且,缓解期患者血浆中IL-35的水平仍低于健康对照(p<0.001)。在活动期患者,血浆IL-35的水平与血小板数呈显著正相关关系(r=0.5335,p<0.001),但在治疗组和未治疗组之间无明显差异。实时定量PCR结果显示,活动期ITP患者P35mRNA表达水平低于缓解期患者和健康对照,缓解期患者与健康对照相近。而EBI3的mRNA表达变化在活动期,缓解期患者和健康对照之间没有显著差异。 结论：以上结果显示,IL-35在活动期ITP患者外周血血浆内明显降低,并且与血小板数密切相关,提示IL-35直接反映了疾病的活动状态,可能促进了调节性T细胞的失能,在ITP的发病中具有重要作用。活动期ITP患者IL-35P35亚基mRNA的表达减低,提示在ITP患者中可能由于P35亚基在转录水平的低表达导致外周血血浆中IL-35水平下降。