马齿苋多糖调控胰岛β细胞自身胰岛素抵抗的机制研究

天然药物资源由于其来源广、副作用小、价格低廉、疗效相对稳定等特点日益受到人们的关注。马齿苋多糖(Portulaca oleracea L. polysaccharides, POPs)是传统中草药马齿苋的主要活性成分之一,具有降糖、调脂、抗菌消炎、抗氧化等多种功效。国内外研究从马齿苋多糖的分离、纯化、结构解析、生物活性(抗氧化、降糖调脂)等方面进行了报道。但有关马齿苋多糖降糖作用的分子机理研究尚未见报道。本论文在前期研究基础上,从以下几个方面分析了马齿苋多糖抗糖尿病的作用机理： 1、建立胰岛素抵抗模型：以胰岛β细胞(HIT-T15)为研究对象,以不同浓度的高脂(棕榈酸)或高糖高脂作为诱导剂,分别诱导1h、4h、8h、24h、48h、72h后,进行细胞生存能力检测。确定最佳诱导条件为：棕榈酸为0.5mol/ml、葡萄糖为33.3mol/ml、处理时间为24h。 2、检测马齿苋多糖对胰岛p细胞生存活力的影响：将HIT-T15细胞(5×104/m1)接种于96孔板,培养24h后,分为空白对照组、胰岛素抵抗模型组、马齿苋多糖处理组,分别用含马齿苋多糖(0.01、0.1、1.0mg/m1)的RPMI1640培养基培养,在不同时间点(2、4、8、24、48、72h)应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、中性红摄取(NRU)法、乳酸脱氢酶(LDH)释放法进行细胞生存活力检测。结果表明,马齿苋多糖具有抑制高脂或高糖高脂诱导的胰岛p细胞死亡,促进胰岛p细胞增殖的作用。 3、马齿苋多糖对胰岛素信号转导通路中相关分子靶的mRNA和蛋白质表达的影响。将HIT-T15细胞(1×105/m1)接种于培养板,培养24h后,分六个组：空白对照组、高脂诱导胰岛素抵抗组、高糖高脂诱导胰岛素抵抗组、马齿苋多糖处理高脂诱导胰岛素抵抗组、马齿苋多糖处理高糖高脂诱导胰岛素抵抗组和马齿苋多糖组,分别用马齿苋多糖(0.1mg/ml)处理24h后,提取各组细胞的蛋白质和RNA,运用蛋白质免疫印迹(Western bloting)和逆转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-PCR)两种技术,检测与胰岛素抵抗相关信号转导通路中的磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K)、c-jun氨基末端激酶(JNK)、胰十二指肠同源盒因子(PDX-1)、PPARr、STAT-5B等靶分子的基因(mRNA)和蛋白质表达,从分子水平阐明马齿苋多糖调控胰岛p细胞自身胰岛素抵抗的分子机制。结果显示,高脂和高糖高脂处理HIT-T15细胞,可抑制胰岛素抵抗相关信号通路中的IR、IRS-2、PI-3K、AKT、GLUT-1、 GLUT-2抑制PDX-1、PPARr、STAT-5B等靶分子的表达,并激活c-jun氨基末端激酶(JNK)信号通路。当用马齿苋多糖处理后,可明显上调IR、IRS-2、PI-3K、 AKT、GLUT-1、GLUT-2、PDX-1、PPARr、STAT-5B等靶分子的蛋白和mRNA的表达,下调c-jun氨基末端激酶(JNK)通路中JNK1、P38、ERK、RAS蛋白的表达。 本论文从建立胰岛p细胞自身胰岛素抵抗模型入手,在细胞分子水平探讨了马齿苋多糖对胰岛素信号通路中相关分子靶的mRNA和蛋白表达的调控,综合分析马齿苋多糖保护胰岛p细胞、降低血糖的细胞分子调控机制,以期发现新的马齿苋多糖降糖作用靶点,为开发具有自主知识产权的创新药物奠定理论基础。