6种大豆异黄酮单体的分离、纯化及稳定性研究

大豆异黄酮(Soybean Isoflavones)是大豆生长过程形成的次级代谢产物,被称为“植物雌激素”,是大豆中一类重要的生理活性物质。大豆异黄酮的天然存在形式主要有12种,可以分为3类,即大豆苷类(daidzin group)、黄豆苷类(glycitin group)和染料木苷类(genistin group),他们分别以游离型、葡萄糖苷型、乙酰基葡萄糖苷型和丙二酰基葡萄糖苷型4种形式存在。目前,中国计量科学研究院仅可以提供大豆苷、黄豆苷和染料木苷的三种大豆异黄酮二级标准物质,其余种类大豆异黄酮标准品主要由sigma等国外大公司控制,价格昂贵,因此研究制备高纯度的大豆异黄酮标准物质具有重要的实际意义。 目前应用制备型高效液相色谱技术制备大豆异黄酮单体的研究主要局限在苷元型或糖苷型的分别制备,未见关于大豆异黄酮多种苷元和糖苷的同时制备研究报道。本实验的目的是根据大豆异黄酮的理化性质,采用制备液相系统对大豆异黄酮总提取物进行分离,探讨改进同时制备6种高纯度异黄酮的制备液相色谱方法,包括3种糖苷型：大豆苷(daidzin)、黄豆黄苷(glycitin)、染料木苷(genistin)和3种苷元型：大豆素(daidzein)、黄豆黄素(glycitein)、染料木素(genistein),为丰富大豆异黄酮标准物质制备技术奠定基础。 研究方法首先采用超声波辅助有机溶剂法提取大豆异黄酮粗提物,该方法具有节能省时、操作简便的优点。然后采用大孔吸附树脂对提取物进行纯化处理后,可有效除去大部分的杂质。且采用40%、50%、60%、70%的乙醇溶液进行洗脱,可有效地将糖苷型和苷元型大豆异黄酮进行分离,最终大豆异黄酮得率为5.18%。 其次,建立了应用制备型高效液相色谱(PHPLC)分离制备高纯度的大豆异黄酮单体的方法。采用SHIM-pack PRC-ODS (20mm×250mm,5μm)制备柱,考察了流动相组成、流速、进样量等因素对分离度的影响,确定了最佳色谱条件为：乙腈-水流动相梯度洗脱,进样量800μL,流速10mL/min,在110min内实现了6种异黄酮单体的基线分离及制备。 经超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)和傅里叶变换红外光谱(FT-IR Spectrometer)鉴定,6种异黄酮单体依次为大豆苷、黄豆黄苷、染料木苷、大豆素、黄豆黄素、染料木素。采用峰面积归一化法得到6种产品的纯度分别为95.54%、90.14%、100%、100%、96.27%、100%。方法具有简便易行、稳定性好、产品纯度高等特点,适用于大豆异黄酮标准品的制备。 标准物质稳定性研究是标准物质研制工作中的重要组成部分。经过一个月的短期稳定性考察和六个月的长期稳定性考察结果表明,随着温度的升高和保存时间的增加,实验室条件下制备的大豆异黄酮标准物质纯度稳定性良好,而浓度却增加,可能由于液体标样中甲醇的挥发性引起。日后有待进一步的完善。 总之,本研究创新性地建立了应用制备型高效液相色谱制备6种大豆异黄酮单体的方法,尽管本研究距离产业化生产还有一定的差距,但可以为实验室的科研工作奠定基础,为标准物质的研制方法提供了参考。