研究目的：骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cells, BMSCs)是目前研究最多、应用潜力最大的干细胞之一,是研究增殖与分化机理的理想模型。但是,骨髓中BMSCs含量极少,长期增殖活性弱,扩增速度慢,逐渐向脂肪老化,无法满足大量的临床需求。众多的体外转染和体内移植研究表明,移植的BMSCs增殖活力不够,存活量较少,严重限制了BMSCs的应用研究。而且BMSCs成骨活性弱,骨化过程较慢,因此,如何提高BMSCs的成骨潜能是近年来研究的热点。补肾中药提取物龟板及其有效成分可以诱导干细胞向成骨分化。近几年来本课题组着重探讨了补肾龟板对各类干细胞的定向分化作用。积累了丰富的前期研究工作基础。前期研究发现龟板提取物促进BMSCs向成骨分化可能与其内的小分子脂肪酸类、脂肪酸酯类、甾体直接进入细胞膜作用内部核受体有关。龟板提取物可上调BMSCs定向成骨分化过程中维生素D受体(vitamin D responsive, VDR)的表达,这在一定的程度上揭示龟板促进BMSCs定向成骨分化的可能机制。因此,本研究在前期工作的基础上深入研究探索龟板及其有效成分靶向VDR对骨髓间充质干细胞成骨分化作用的分子机制研究。研究方法：1.通过lncRNA芯片技术分析龟板有效成分差异性表达情况,运用生物信息学方法,预测分析差异性表达的lncRNA共表达基因,预测分析其共表达的靶基因,运用生物学功能聚类分析的方法了解其参与成骨分化的相关情况,通过trans和cis预测分析差异性lncRNA参与基因的调控机制,构建TF-lncRNA-靶基因三者的网络关系。2.构建了维生素D受体反应元件(vitamin D responsive element, VDRE)驱动的荧光素酶(Luc)报告基因系统,确定了VDR这一核受体靶基因对龟板促成骨分化活性成分反应元件,寻找出促BMSCs成骨分化的最佳龟板提取物(PTE)组分。3.转染维生素D受体(VDR)与其功能区截断体到骨髓间充质干细胞(BMSCs)中,观察何种核受体功能区在龟板有效成分促成骨分化中起作用。4.以龟板及其有效成分干预BMSCs,正常BMSCs作为对照组,通过miRNA基因芯片筛查及qRT-PCR进行验证,发现成骨分化方面有关的miRNA信息。5.结合前面miRNA基因芯片和qRT-PCR信息,筛选出miRNA-351,其靶基因为VDR mRNA,特引入rno-miR-351 mimic与预测靶基因VDR 3'UTR双荧光素酶检测,以验证miRNA是否抑制候选靶基因翻译水平。研究结果：1.通过lncRNA基因芯片的分析结果发现了龟板有效成分差异性表达的lncRNA和mRNA。2. pathway和GO聚类分析确定了分子之间的生物学功能,并进一步分析了龟板有效成分差异性表达的lncRNA与TF及cis调控的关系。3.通过trans分析,构建了lncRNA-mRNA-转录因子三元共调控网络。4.时效表达初步结论：各组分均有不同程度的促进作用。不同剂量的结构类似物在药物作用最佳时间点,有不同程度的促进作用,30 μ g/mL对VDRE的表达效率最高。5.4甾酮(S9)是作用于VDR的配体结合结构域(pCMV-Myc-VDR-C)而促进BMSCs成骨分化的。6.经过基因芯片检测数据进行分析,我们发现经过龟板总提取物(2B)、S9干预后,miRNA-330-3p、miRNA-200a-5p、miRNA-296-3p表达上调,同时miRNA-615. miRNA-351-3p、miRNA-129-1-3p、miRNA-466b-2-3p、miRNA-466b-1-3p表达下调。7.筛选出的miRNA-351模拟物可有效抑制VDR的表达,而在转染miRNA-351抑制剂组则可促进VDR蛋白的表达,miRNA-351与VDR有相应的结合位点,能在其翻译水平有效抑制VDR的表达。研究结论：祖国传统中药龟板及其有效成分可靶向VDR促进BMSCs成骨分化,其机制之一是通过抑制miRNA-351表达,增强VDR翻译水平,初步发现在调控成骨分化的过程中所形成的“中药小分子物质-miRNA-mRNA-lncRNA"的多元调控网络。
