不同茯苓菌丝体的多糖结构和生物活性

近年发现，真菌多糖是优良的免疫调节剂，它们不仅对多种疾病具有显著疗效而且能抑制肿瘤生长或阻止病毒感染，而对正常细胞无毒副作用。然而，只有某些真菌多糖才显示出抗肿瘤活性，甚至从不同真菌中分离出的相同化学结构的（1→3）-β-D-葡聚糖其生物活性截然不同。据报道，细胞表面的受体蛋白质具有不同立体形态，它们对多糖分子链的构象有特异识别能力从而起不同作用。由此认为，多糖在溶液中的链构象对其生物活性的影响比一级结构更为重要。多糖的分子量、分子尺寸和链构象（刚直链、无规线团、单一、双一及三螺旋和聚集体等形态）主要依靠高分子溶液理论和方法来确定，而真菌的培养和分离提取以及生物活性试验又涉及生物学和医学领域。因此研究真菌多糖结构和链构象及其与生物活性的关系属于高分子物理和生物化学交叉学科的新领域，也是国际前沿领域之一。本论文主要通过生物发酵工程技术培养不同的茯苓菌丝体，并且从中提取和纯化得到水溶性和碱溶性多糖并制备它们的衍生物，然后，研究它们的化学结构、溶液中的链构象和抗肿瘤活性，并探讨多糖及其衍生物的生物活性机理以及它们的结构与生物活性之间的构效关系。 本工作的主要创新是：（1） 首次弄清了茯苓菌丝体中六种多糖的结构和分子量以及不同培养基对茯苓菌丝体中各种多糖的化学组成、分子量和链构象的影响；（2） 首次揭示不同菌种和不同培养基培养的茯苓菌丝体水溶性多糖具有不同的抗肿瘤活性，而且含玉米浆培养基培养的菌丝体杂多糖显示明显高的抗肿瘤活性；（3） 确定碱溶液提取的水不溶性多糖—（1→3）-α-D-葡聚糖在0.25 M LiCl／二甲基亚砜（DMSO）中呈现较伸展的柔顺链构象；（4） 揭示水不溶性（1→3）-α-D-葡聚糖分子链上引入硫酸酯基后，其衍生物水溶性提高且链刚性增大，同时抗肿瘤活性明显提高；并且证明（1→3）-α-D-葡聚糖硫酸酯衍生物具有诱导人乳腺癌细胞MCF-7凋亡的作用，并使MCF-7细胞周期明显阻滞于G0／G1期，且对正常细胞无毒副作用；（5） 采用液体深层发酵技术对野生茯苓菌种进行了50升发酵罐的中试，并成功地培养出批量茯苓菌丝体，而且证明其水溶性杂多糖具有较高的抗肿瘤活性：（6） 采用一种新的乳液相分离法制备包合牛血清白蛋白（BSA）的壳聚糖／羧甲基纤维素微胶囊，它具有明显的pH选择性释放功能。 本论文主要研究内容和结论概括如下。由野生茯苓菌种采用两种不同培养基培养出茯苓菌丝体，并且依次用0.9％NaCl、热水、0.5M NaOH水溶液和88％甲酸从中分别提取出六种不同的多糖，同时从培养液中提取出胞外多糖。红外光谱（IR）、气相色谱（GC）、13C NMR等分析结果表明这两种菌丝体中相应的七种多糖的化学组成基本相同，其中PCM-0，PCM-1和PCM-2为杂多糖，PCM-3-I为（1→3）-α-D-葡聚糖，PCM-3-Ⅱ和PCM-4为（1→3）-β-D-葡聚糖。值得提出，α-和β-D-葡聚糖同时存在于碱提取的多糖中，但可通过醋酸中和后分离。通过激光光散射（LLS）和粘度法测定了这些多糖的重均分子量（Mw）、均方根旋转半径(2>（1/2）)和特性粘数（[η]）。不同的培养基配方得到的菌丝体多糖的蛋白质含量和分子量不同，且在溶液中呈现不同的链构象。其中由含玉米浆培养基培养的茯苓菌丝体中 提取的多糖具有较高的蛋白质含量、相对低的分子量以及相对卷曲的链构象。另 外，从两种培养液中用甲醉沉淀提取出胞外多糖（场七.PCMO和wc一PCMO），它们 的化学结构和为‘也不完全相同。 用植入BALBlc小鼠体内的Sarco力以aL-180（S一180）实体瘤进行获荃菌丝体水溶 性杂多糖的体内活性测试，用白血病细胞株HL.60和肝炎细胞株HepG:进行体外 活性试验，并且用正常猴子肾脏细胞测试多糖的毒性。由两种获荃菌种和两种不 同培养基配方培养出的四种获荃菌丝体中的多种水溶性杂多糖具有不完全相同的 单糖组成、结合蛋白含量和分子量，并且显示出对S一180明显不同的抑制率。小鼠 移植S一180实体瘤试验表明，用野生获荃菌种从玉米浆培养基培养的菌丝体中提取 的杂多糖在体内具有最高的抗肿瘤活性。数皮培养基培养的菌丝体中提取的水溶 性多糖则不显示体内抑瘤活性。体外肿瘤细胞培养试验证明，四种获荃菌丝体的 水溶性多糖均有抑制悬浮细胞株HL.60人白血病细胞增殖的活性，而对贴壁细胞 株HePGZ肝癌细胞的抗增殖活性较低。由此证明，化学结构、蛋白含量、分子童、 链构象对多糖的生物活性都有影响，其根源在菌种和培养基成分。 以0.25 M LIC】/DMSO为溶剂，丙酮和0.25 M LIC】/DMSO（l:4）混合液为 沉淀剂，用重沉淀分级法将(l峥3卜小D一葡聚糖(桃一PCM3一D成功地分成十个级分。 通过激光光散射和粘度法测定各级分在0.25 M Lic.Mso中25oc下的Mw、‘护>’口 和【司数据.由此建立了该葡聚糖在分子童范围4.16、104到29一10’的 Mark一Houw奴止方程:【川=（9.77士0.1）x 10-5从0.77t”.02（c时扩）。同时，按照高分子 溶液理论计算出分子链构象参数，如单位围长摩尔质量（ML）、持续长度(砂和 极限特征比（C）依次为69伽口一，4.snm和11.9.由此得出，(l峥3卜a-D一葡聚糖 PCM3一I在0.25 M LIC四MSO中呈现一种较伸展的柔顺链构象。 水不溶性获荃a-D·葡聚糖通过氛