目的：
观察柴胡疏肝散及拆方对慢性应激抑郁模型大鼠行为学及额叶皮质、海马p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)和细胞外信号调节激酶5(ERK5)表达的影响,探讨柴胡疏肝散抗抑郁效果及其作用机制。
方法：
1.将健康成年雄性SD大鼠随机分六组：①正常组、②抑郁模型组、③柴胡疏肝散全方组(CHSGS组)、④柴胡疏肝散拆方Ⅰ组(拆方I组)、⑤柴胡疏肝散拆方Ⅱ组(拆方Ⅱ组)、⑥氟西汀组。
2.采用慢性轻度不可预见性应激(CUMS)建立抑郁大鼠模型。并给予相应药物灌胃。
3.分别于造模第1天(应激前)、14天及28天测量各组大鼠体重、观察敞箱试验和糖水消耗试验各项行为学指标变化。
4.采用放射免疫方法测定各组大鼠血清肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6、)含量。
5.应用免疫组织化学法及蛋白质印迹技术(Western-blotting)检测各组大鼠额叶皮质、海马p38MAPK、ERK5的分布、表达及磷酸化水平差异。
6.应用实时荧光定量Real-Time PCR技术测定各组大鼠额叶、海马p38MAPK mRNA、ERK5mRNA的表达差异。
结果：
1.实验第1天各组大鼠体重及行为学指标无明显差别,差异无统计学意义(P>0.05)。经过14-28天CUMS,模型组大鼠体重增加缓慢。敞箱试验中水平运动、垂直运动得分减少；清洁动作次数减少；中央格停留时间延长。总液体消耗、糖水消耗明显减少,糖水偏爱百分比明显降低。与正常组比较,差异均具有显著性(P<0.01)。
2.经14天灌胃,与模型组相比,CHSGS组大鼠体重增加；水平运动、垂直运动得分及清洁动作次数增加,中央格停留时间明显减少；糖水消耗量及糖水偏爱百分比增加,差异均具有显著性(P<0.01或P<0.05)。拆方I组、拆方Ⅱ组、氟西汀组各项指标与模型组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。经28天灌胃,CHSGS组及氟西汀组与模型组比较,大鼠体重明显增加,行为学各项指标明显改善,差异有显著性(P<0.01或P<0.05)。拆方Ⅰ及Ⅱ组同模型组相比,仅部分测量指标改善(P<0.05或P<0.01)。CHSGS组与氟西汀组各项指标比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。
3.模型组大鼠血清TNF-α、IL-6含量明显升高。与正常组相比,差异具有显著统计意义(P<0.01)。CHSGS组、氟西汀组与模型组相比TNF-α、IL-6水平降低,差异均有显著统计学意义(P<0.01)。拆方Ⅰ、Ⅱ组与模型组相比,TNF-α水平无明显改变,差异均无统计学意义(P>0.05)。拆方Ⅰ组IL-6水平降低,同模型组相比,差异有显著性(P<0.05)。
4.免疫组化结果显示：p38MAPK及ERK5免疫反应阳性细胞在各组大鼠额叶、海马均有表达。与正常组比较,模型组额叶及海马p38MAPK表达增加,灰度值降低,差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较,CHSGS组和氟西汀组额叶、海马p38MAPK表达减少,灰度值增加(P<0.05或P<0.01)。拆方Ⅰ、Ⅱ组大鼠海马p38MAPK表达与模型组相比,差异均无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠额叶海马组织ERK5免疫反应阳性细胞数改变不明显,平均灰度值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。VWestern-blotting定量分析显示：与正常组比较,模型组额叶、海马p38、p-p38MAPK,p-p38/p38MAPK均明显增加,差异具有显著性(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较,CHSGS组和氟西汀组额叶、海马p38、p-p38及p-p38/p38MAPK均降低(P<0.05)。拆方Ⅰ、Ⅱ组与模型组比较,额叶及海马p38、p-p38及p-p38/p38MAPK均无明显差别,差异无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠额叶及海马ERK5蛋白表达量均无明显变化(P>0.05)。模型组大鼠额叶及海马p-ERK5、p-ERK5/ERK5水平明显降低,与正常组比较,差异具有显著性(P<0.01或P<0.05)。与模型组相比,CHSGS组额叶及海马p-ERK5、p-ERK5/ERK5明显增加；氟西汀组海马p-ERK5、额叶及海马p-ERK5/ERK5增加,同模型组比较,差异均具有显著性(P<0.05或P<0.01)。拆方Ⅰ组及Ⅱ组p-ERK5p-ERK5/ERK5水平降低,与模型组相比,差异均无显著性(P>0.05)。
5.RT-PCR结果示：各组大鼠额叶、海马均可见p38MAPK、ERK5的mRNA表达。模型组额叶、海马p38MAPK mRNA表达量较正常组上调,两者差异具有显著性(P<0.05或P<0.01)。CHSGS组、拆方Ⅰ、Ⅱ组及氟西汀组额叶p38MAPK mRNA表达量与模型组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。与模型组相比,CHSGS组及氟西汀组大鼠海马p38MAPK mRNA表达量降低,差异具有显著性(P<0.05)。各组大鼠额叶皮质及海马ERK5mRNA表达量比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。
结论：
1.抑郁模型组大鼠体重增加缓慢、各项行为学指标明显异于正常组,说明抑郁模型大鼠食欲减退,体重减轻,兴趣及快感丧失,活动减退,与临床抑郁症状相似。经氟西汀抗抑郁治疗后上述行为明显改善,证明抑郁模型复制成功。
2.柴胡疏肝散可逆转各项异常抑郁样测量指标,说明其具有抗抑郁作用。其抗抑郁效果与氟西汀相当且起效快。柴胡疏肝散全方抗抑郁效果优于其拆方Ⅰ、Ⅱ。提示疏肝解郁在抗抑郁治疗中的重要作用；并认为柔肝活血能加强疏肝解郁的功效。
3.抑郁大鼠血清炎性因子TNF-a及IL-6含量增高,柴胡疏肝散降低其血清浓度。
4.慢性应激所致抑郁症与脑内p38MAPK表达增加、p-ERK5表达降低有关。柴胡疏肝散下调大脑,尤其是海马p38MAPK,上调p-ERK5表达。提示柴胡疏肝散可有效抑制p38MAPK、激活ERK5信号通路的活化达到抗抑郁作用。为柴胡疏肝散组方的合理性及治疗抑郁症提供了实验依据。
