广陈皮植物化学物生物活性及橙皮素抑制乳腺癌细胞活性机理研究

流行病学及临床研究表明多吃富含植物化学物的水果、蔬菜及谷物能降低癌症、心血管疾病和糖尿病等慢性疾病发生的风险。这些植物化学物的生物活性会受到植物发育和食物加工制备过程的影响。通过研究果蔬综合利用过程中植物化学物及生物活性的变化,对于开发和利用功能性食品有重要的理论意义。陈皮是芸香科植物橘及其栽培变种的干燥成熟果皮,在中国及东南亚等国家已经有数百年的历史。陈皮具有药食同源的特点,既可以作为烹饪调料用于煲汤或熬粥,同乌龙、普洱一起泡茶,制作凉果等零食等;也作为传统中药使用,具有理气健脾,燥湿化痰的功效。陈皮可分为“陈皮”和“广陈皮”。其中广陈皮来源于产自广东省江门市新会区的茶枝柑,因其独特的药用价值,被质检总局批准成为国家地理标志保护产品。本研究系统地分析了果实成熟对茶枝柑中植物化学物、抗氧化活性和抗增殖活性的影响;探究了干燥和陈化过程对广陈皮品质、植物化学物以及生物活性的影响。继而通过体外消化模型,比较广陈皮在消化过程中酚类化合物、抗氧化和抗炎活性的变化。广陈皮中的橙皮素具抑制乳腺癌细胞增殖的作用,利用高通量测序分析转录组变化,研究了橙皮素抑制乳腺癌细胞活性的作用机制,并比较橙皮素对雌激素受体依赖型和非依赖型的乳腺癌细胞的抑制机理的异同。主要研究结果如下:1.茶枝柑成熟过程中,果皮中总酚含量,抗氧化活性,以及橙皮苷和橘皮素含量都随之增加,而抗增殖活性和川陈皮素含量则有所降低。果肉中维生素C含量增加,而总酚含量,ORAC值和抗增殖活性降低。果籽中总黄酮含量和抗氧化活性则相对稳定。在青果,微红果和大红果三个阶段,相比果肉和果籽,果皮中总酚、总黄酮及各种酚类化合物含量最高,抗氧化及抗增殖活性最好。而果籽和果肉的总黄酮含量、抗氧化和抗增殖活性相当。2.广陈皮制备和陈化期间,相比结合态提取物,游离态提取物中总酚、黄酮以及酚类化合物含量较高,抗氧化及抗增殖活性较好。但是,在陈化过程中,结合态在总量中的占比逐渐增加,结合酚,结合黄酮含量及其抗氧化和抗增殖活性显著提高。多变量数据分析将不同陈化时期的样品明显区分开,这主要是由广陈皮陈化过程中结合态酚类物质累积导致。在样品PCR01开始陈化的两年里,总酚,总黄酮及其特征性化合物橙皮苷都有显著增加,尤其在结合态提取物中增加更为显著,表明陈化初期发生的酚类物质转化过程。3.广陈皮在体外消化过程的总酚和总黄酮含量显著降低,但在消化酶的作用下总酚含量逐步增加。其中酚酸类化合物得到充分释放和累积,而黄酮类化合物释放程度较弱。值得注意得是橙皮素在复合酶消化过程中得到转化并大量累积。消化过程中的体外抗氧化活性及细胞抗氧化活性与其总酚含量呈显著相关。广陈皮经体外消化处理以后能有效抑制LPS诱导的iNOS及炎症因子TNFα,IL-1β和IL-6的mRNA水平表达,表现出较好的抗炎活性。4.橙皮素能够有效抑制雌激素受体阳性的乳腺癌细胞MCF-7生长,利用高通量测序技术,分析橙皮素处理4 h和24 h两个时间点的MCF-7细胞基因表达谱,发现橙皮素处理4h有94个差异表达基因,其中43个上调基因,51个下调基因;而处理24h则产生了 491个差异表达基因,其中292个上调基因,199个下调基因。基于GO和KEGG富集分析表明橙皮素抑制乳腺癌MCF-7细胞活性主要涉及内质网应激、MAPK信号通路和雌激素代谢调控。通过蛋白交互作用网络分析,确认橙皮素在转录水平作用的枢纽基因,包括4h的EGR1,SOCS1,EGR3,NR4R1,NFATC 和 GATA4;24h的POTTE,MYC,VEGFA,EGF,EPRS,HSPA1A和CD44。进一步比较橙皮素处理MCF-7细胞4h和24h共同上调和下调的表达差异基因,并进行GO分析,上调差异基因主要参与细胞内钙离子平衡的生物过程,而下调差异基因主要是在细胞核中,参与响应葡萄糖,DNA转录及响应胰岛素等生物过程,其中EGR1,MAFA和TXNIP等基因参与了多个GO Term,也是癌症预防和治疗中的重要靶点。进一步分析橙皮素对雌激素受体阴性的乳腺癌细胞MDA-MB-231的作用。橙皮素能够有效抑制MDA-MB-231细胞增殖。通过分析橙皮素在不同时间点(1 h,4 h,24 h和48 h)对MDA-MB-231细胞的关键酶和转录因子在转录水平的调控。发现涉及内质网应激和MAPK信号通路的关键基因主要是在中后期发生变化,与MCF-7细胞中的结果相似。然而,MDA-MB-231细胞中橙皮素抑制CYP1A1和CYP1B表达,刺激INSIG1表达,这些涉及雌激素代谢和调控的基因的作用与MCF-7细胞中的结果呈现不同的趋势。