ROS诱导的氧化胁迫与细胞凋亡对百子莲愈伤组织超低温保存细胞活性的影响机制

本文研究了百子莲(Agapanthus praecox ssp.orientalis)胚性愈伤组织(Embryogenic callus,EC)和非胚性愈伤组织(No Embryogenic callus,NEC)超低温保存中活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)诱导的氧化胁迫与细胞程序性死亡(Programmed Cell Death,PCD)的作用机制,用以指导百子莲超低温保存体系的外源添加物质的优化;并且在生理生化层面验证最佳外源添加物质对百子莲NEC超低温保存中ROS代谢与抗氧化系统以及PCD的调控作用。研究结果如下:1、百子莲EC和NEC超低温保存中ROS诱导的氧化胁迫和PCD(1)百子莲EC和NEC冻后细胞相对活性与膜脂过氧化水平有很大关系。在超低温保存过程中,MDA含量的升高标志着膜脂过氧化程度的加剧,其中脱水和洗涤是产生氧化胁迫的主要步骤。ROS主要组分H2O2是百子莲超低温保存中诱导氧化胁迫的主要因素。(2)POD、CAT和SOD是百子莲EC和NEC超低温保存中主要的抗氧化酶。它们通过清除植物体内的H2O2,减弱氧化胁迫的危害。抗氧化的相关基因CAT、Fe SOD、Cu/Zn SOD、peroxiredoxin、peroxidase、的差异表达也证明了抗氧化酶在超低温保存中的重要意义。(3)在百子莲超低温保存过程中,PCD的发生是导致细胞冻后相对活性偏低的重要因素,细胞相对死亡率与PCD的发生程度变化趋势相同。细胞凋亡是超低温保存中的主要PCD类型,超低温保存的整个过程都伴随着PCD的发生。其中,脱水和洗涤是细胞凋亡发生的关键步骤,这与MDA的变化趋势相同,进一步验证了ROS是诱发PCD的开关这一推论。PCD关键基因cytochrome c biogenesis C、caspase和DAD1的差异表达也证明了PCD在百子莲超低温保存过程中的发生。2、百子莲NEC超低温保存体系优化(1)基于以上研究,选取5种不同浓度的抗氧化剂与细胞凋亡抑制剂对百子莲EC和NEC超低温保存体系进行优化。结果表明,添加外源物质的百子莲EC和NEC超低温保存后相对成活率均不同程度的提高,其中细胞凋亡抑制剂D-CHO优化效果最好,使EC冻后存活率提高到89.9%,使NEC冻后存活率提高了58.7%;抗氧化剂Cinnamtannin B-1优化效果次之,使EC冻后存活率提高到86.8%,使NEC冻后存活率提高到52.7%。(2)分别以1.0μmol/LD-CHO和0.06mmol/LCinnamtannin B-1为外源添加物质,建立了优化的百子莲NEC超低温保存体系。(3)外源抗氧化剂Cinnamtannin B-1降低了H2O2的含量,并显著降低了百子莲NEC超低温保存中膜脂过氧化水平,保护了细胞内的膜结构。Cinnamtannin B-1还显著提高了百子莲NEC中POD和CAT的活性,调节植物体内的氧化还原平衡来提高抗氧化能力。(4)细胞凋亡抑制剂D-CHO明显缓解了百子莲NEC超低温保存中PCD的发生程度,并且显著提高了细胞的冻后存活率,从而成功优化了百子莲NEC超低温保存体系。