超低温保存是一门应用于动植物种质保存及低温医学领域的新生物技术,是低温生物学的研究热点之一,但目前关于其保存机理尚不完全清楚,也限制了该技术的发展。芍药属植物是我国的传统花卉,资源丰富,但保存技术单一。本研究以牡丹花粉为材料,对花粉超低温保存前后的差异表达蛋白质进行了研究,以探索超低温保存分子作用机制；同时研究了芍药属植物超低温保存技术,为补充和完善该属资源保存提供新技术。具体结果如下：
1.建立了花粉蛋白质双向电泳技术平台。采用TCA/丙酮沉淀法提取牡丹花粉可溶性蛋白质,80000Vhs进行第一向等电聚焦可以获得高分辨率、重复性好的蛋白质双向电泳图谱。该蛋白质提取方法也适用于芍药、百合、玉兰以及梅花花粉可溶性蛋白质提取。
2.获得了81个超低温保存差异表达的蛋白质。不同品种超低温保存、以及同一品种保存不同时间有共同的差异表达蛋白质,认为它们可能与花粉在超低温逆境下的应激反应和保护机制有关。
3.对其中27个差异蛋白质进行质谱鉴定分析,有18个蛋白质得到有效鉴定。分属14种不同的蛋白质,其功能分别涉及能量代谢、渗透胁迫、细胞骨架、蛋白质加工等方面。
4.建立了芍药属植物超低温保存花粉库。保存牡丹、芍药野生种／亚种8个,牡丹栽培品种76个,芍药栽培品种53个,花粉保存时间从1-6年不等。
从2007-2009年,超低温花粉库中有22个芍药种／品种花粉应用于杂交育种工作,授粉花朵数超过1000朵,获得杂种苗500余株,为后期的研究奠定了基础。
5.建立了牡丹胚的玻璃化超低温保存技术程序,采用该程序保存‘凤丹白’和‘大藤锦’胚,其再生成活率分别为92.3±2.6%和90.7+3.9%。
牡丹胚超低温保存程序为：分离的成熟胚装入冻存管中,加入loading溶液室温装载40min,0℃低温下用PVS2溶液处理40min后,更换新鲜PVS2并迅速投入液氮保存,从液氮中取出后用30℃水浴化冻60s,unloading溶液重复洗涤两次,每次10min,然后接种到再生培养基上暗培养1周后进行正常培养。
6.建立了芍药胚的玻璃化超低温保存技术程序,采用该程序保存‘红盘托金’,其再生成活率为96.2±3.1%；保存芍药、新疆芍药、块根芍药和川赤芍,其再生成活率分别为94.9±4.6%,88.8±4.5%,85.4±5.4%,82.0±5.0%。
芍药胚的超低温保存程序为：分离的成熟直接采用loading溶液室温装载20min, 0℃低温下用PVS2溶液处理60min后,更换新鲜PVS2并迅速投入液氮保存,液氮取出后用40℃水浴化冻60s,unloading溶液重复洗涤两次,每次1 Omin,然后接种到再生培养基上进行培养。暗培养1周后转入正常培养程序。
7.探索了牡丹、芍药休眠芽茎尖超低温保存技术。
超低温保存后暗培养1-2周,‘凤丹白’茎尖成活率最高仅有9.5±1.2%,‘粉玉奴’茎尖最高成活率为20.4±7.7%。茎尖转入正常光照下培养,由于冻存后恢复生长慢,褐化严重,约20d后茎尖褐变或漂白死亡,没有再生成苗。有待进一步改进技术程序。
本研究的新颖性在于1)首次大规模研究了超低温保存花粉的差异表达蛋白质,鉴定了14类18个超低温保存差异表达蛋白质；2)建立了芍药属植物超低温保存花粉库；超低温保存花粉应用于杂交育种获得500余株杂种苗；3)建立了芍药属植物胚的超低温保存技术程序。
