目的:观察丙戊酸(Valproate,VPA)在体外培养海马神经元癫痫样放电后对细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase 1/2, ERK1/2)、生长相关蛋白( growth associated prorein,GAP-43)和突触体素(synaptophysin, SYP)的影响,从细胞分子生物角度探讨丙戊酸的抗癫痫作用机制。
方法:采用24 h内新生Wistar大鼠,海马神经元用含10%胎牛血清的Neurobasal培养液培养于37℃、5%CO2细胞培养箱。将细胞分为(1)正常对照组(control):正常培养液培养至第9d时,换用正常细胞外液处理3h,运用膜片钳测定细胞活性;(2)模型组(model):将海马神经元培养至第9d时,将培养液换成无镁细胞外液处理3h,去标本运用膜片钳测定细胞放电情况,确定癫痫样放电细胞模型建立成功;(3)丙戊酸组:在量效实验中,于神经元癫痫样放电前30min时加入不同浓度的丙戊酸(50mg/L,75mg/L,100mg/L),运用免疫荧光技术测定pERK1/2在不同浓度时的表达;在时效实验中,分别于癫痫样放电前30min,放电后0min,30min,2h和6h加入50mg/L丙戊酸,采用Western blot观察pERK1/2、GAP-43和SYP的变化。
结果:
(1).运用EPC-10系统进行全细胞模式记录海马神经元癫痫样放电:正常对照组中,神经元培养至第9d时,换成正常细胞外液处理3h,显示神经元在多数时间内处于静息状态,偶尔出现动作电位;模型组中,神经元培养至第9d时,换成无镁细胞外液处理3h,神经元阵发性出现连续的稳定的l0～35mV动作电位,放电频率5～l7Hz,经无镁处理3h,换成正常维持培养基24h后,90%以上的神经元仍呈癫痫样放电;
(2).免疫荧光标记pERK1/2的表达:在正常对照组中,pERK1/2主要在神经元胞浆内表达;模型组中,可以观察到pERK1/2在神经元胞核与胞浆内皆有表达;与模型组相比较,不同浓度的丙戊酸均能显著(p <0.01)抑制海马神经元癫痫样放电后ERK1/2的活化,而不同浓度丙戊酸降低ERK1/2的磷酸化水平的差异无统计学意义(p >0.05);
(3).Western-blot检测pERK1/2、GAP-43和SYP的表达水平:时效实验中,在模型组, GAP-43和SYP在各个时间点的都有表达,30min时,表达达到高峰,与pERK1/2的表达趋势相似;同模型组相比较,加入丙戊酸对ERK1/2的磷酸化、GAP-43和SYP水平在各时间点都有抑制(p <0.01),在放电前30min时最明显。
结论:
1、通过Neurobasal培养液加胎牛血清所培养的海马神经元活性好,经无镁细胞外液处理3h后,所获得的神经元癫痫样放电模型是一种持续稳定的癫痫细胞模型,为今后进一步研究癫痫的发病机制提供了研究对象。
2、海马神经元癫痫样放电后ERK1/2信号转导通路明显被激活,同时反应突触可塑性的蛋白GAP-43和SYP(MFS的标记物)的表达明显增强,此外,广谱抗癫痫药丙戊酸可以干扰ERK1/2的信号转导通路激活的同时,减弱了GAP-43和SYP的表达。
3、本研究从细胞分子生物角度研究了丙戊酸与癫痫后ERK1/2及MFS的关系,探讨了丙戊酸抗癫痫的作用机制。
