维肝力对骨髓抑制小鼠造血调控影响的实验研究

[目的与方法]骨髓抑制是肿瘤病人经放、化疗治疗后常见的造血损伤并发症，表现为外周血白细胞、红细胞、血小板减少。严重的骨髓抑制和外周血细胞下降往往使放、化疗难以继续进行，甚至可引起感染、发烧、出血等严重并发症，因而成为提高肿瘤疗效及减少术后复发的主要障碍。祖国医学认为，骨髓造血障碍的基本病机为脾肾两虚。脾虚则气血生化无源，肾阳虚则机体失于温煦，气血推动无力，肾阴虚则虚热内生，扰血妄行。因此，目前中医治疗放、化疗所致骨髓抑制，多着重于脾、肾，采用补益之法。维肝力是香港维康力公司的上市产品，已应用于艾滋病、肝病的治疗，具有增强机体免疫力的作用。该制剂主要成分包括鹿茸、黄芪、人参、淫羊藿、仙茅、蛇床子、灵芝、丹皮、甘草等多味药材。维肝力在造血调控方面的作用如何，是本研究的关注所在。本课题从造血细胞存活、增殖、造血生长因子、细胞周期、凋亡相关蛋白及骨髓基质金属蛋白酶等多方面、多层次、多途径地对维肝力在造血调控方面的作用进行了较为深入、系统的研究，从细胞、分子水平揭示维肝力的作用机制和作用环节，分析其作用特点，为维肝力临床应用提供有价值的实验依据。 [结果] 1．高剂量维肝力对外周血白细胞、红细胞、血红蛋白及骨髓有核细胞均有显著的提升作用，中、低剂量维肝力对各系外周血细胞也有提升倾向，但对血小板促进作用更明显。 2．体外祖细胞培养显示维肝力能明显增加三系祖细胞（CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-Meg）集落产率。其中，高、中剂量维肝力对粒-单系及红系祖细胞集落的提升作用较明显；低剂量维肝力对粒-单系及巨核系祖细胞集落的增加有明显的刺激作用。 3．维肝力能够使骨髓造血干细胞明显增加，其中，高、中剂量维肝力促增殖作用较为明显，低剂量维肝力对骨髓造血干细胞的促增殖作用相对较弱。维肝力对外周血造血干细胞影响不大。 4．维肝力能促使骨髓抑制小鼠骨髓有核细胞G0／G1期细胞比率下降，S期及G2／M期细胞比率增多。说明维肝力可明显促进骨髓造血细胞从静止期进入细胞周期，加速DNA合成及有丝分裂的进程，促进造血细胞增殖，有利于造血功能的迅速恢复。 5．免疫组化实验结果表明维肝力在上调Bcl-2蛋白表达同时，下调Bax蛋白表达，Bcl-2／Bax比值增大，有助于防止骨髓造血细胞凋亡。原位杂交实验结果表明，Bcl-2、Bax蛋白的变化与Bcl-2 mRNA、Bax mRNA的变化是一致的，提示维肝力对Bcl-2、Bax蛋白水平的调节可能是在转录和翻译水平上实现的。 6．维肝力对IL-6、FL分泌水平具有较好的调节作用，使其水平维持在适当的范围内，有利于造血微环境的稳定，促进造血的恢复。维肝力对GM-CSF水平影响不大，也没能明显改变小鼠骨髓基质细胞及脾组织细胞内TPOmRNA的表达水平。维肝力对骨髓抑制小鼠造血调控似为通过多种细胞因子、途径协调作用的结果。 7．维肝力对骨髓基质proMMP-2、proMMP-9的活性具有一定的上调作用，对MMP-2活性则有下调作用，对MMP-9活性调节作用不明显。提示基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9酶原的活化及其活化酶的抑制对造血可能具有重要的意义。 [结论] 1．本研究首次从造血细胞存活、增殖、细胞周期、凋亡相关基因（Bcl-2、Bax）、造血生长因子（IL-6、FL、GFM-CSF、TPO）以及骨髓基质金属蛋白酶（MMP-2、MMP-9）等多方面对维肝力在造血调控方面的作用及机制进行了较为深入、系统的研究，证实了维肝力对辐射和化疗药物所致骨髓抑制具有一定缓解作用，能在一定程度上促进骨髓抑制小鼠造血功能的恢复。 2．本研究结果显示，维肝力对骨髓抑制小鼠造血调控可能是通过多种途径、多种层次进行的。一方面促进骨髓细胞进入细胞增殖周期，上调骨髓细胞Bcl-2 mRNA及Bcl-2蛋白表达水平，下调Bax mRNA及Bax蛋白表达水平，抑制凋亡的发生，维持血发生过程中细胞的存活。另一方面通过IL-6、FL等多种细胞因子的协调作用，促进造血恢复。此外，本研究首次发现并提出了基质金属蛋白酶MMP-2、MMP-9酶原的活化及其活化酶的抑制在造血过程中可能具有重要意义。根据研究结果首次提出了维肝力造血调控机制示意图，本研究成果为维肝力临床应用提供有价值的实验依据。