IBS患者结肠组织中microRNA表达谱分析及其意义研究

背景与目的：肠易激综合征(Irritable bowel syndrome, IBS)是一种常见的功能性胃肠疾病,其临床症状主要表现为腹痛、腹胀或腹部不适伴随排便习惯或粪便性状的改变。根据大便性状可将IBS分为IBS-D、IBS-C和IBS-M三种不同的亚型。目前该病的发病机制尚未完全明确,其诊断主要依据以症状学为主的罗马Ⅲ诊断标准,缺乏公认的客观诊断指标。因此,寻找方便、有效的生物学标志,将极大有利于疾病的诊断和治疗。 微小RNA (microRNA, miRNAs)是一组长约18-23nt的内源性非编码RNA,其表达具有组织细胞特异性、发育时序性和进化保守性,在转录后水平调节靶基因的表达,从而参与细胞增殖、分化、凋亡、代谢、氧化应激和人类疾病发生等生理和病理过程。研究发现在IBS患者肠道黏膜中存在着miRNAs表达改变,这提示miRNAs可能参与了IBS的发病过程。 本研究旨在应用miRNA芯片技术,从组织标本中筛选出在IBS-D和IBS-C患者肠粘膜中差异表达显著的miRNAs,并应用生物信息学分析所有差异表达miRNAs的靶基因及其生物学功能,初步探讨miRNAs在该病中发挥的作用,为IBS的分子诊断及治疗奠定基础。 材料和方法： 1.从正常对照组、IBS-D和IBS-C组中各抽出3例患者的乙状结肠粘膜标本用于芯片筛选实验。 2.采用mirVanaTM RNA Isolation Kit提取分离总RNA,使用琼脂糖凝胶电泳检测RNA浓度及质量。 3.利用Agilent Human miRNA芯片(8*60K,V19.0)进行miRNAs的筛选(北京旷博科技公司提供),应用Feature Extraction和Gene Spring12.0软件进行数据分析,以表达相差>2.0倍或<-2.0倍为阈值,找出差异表达显著的miRNAs。 4.应用TargetScan软件对差异表达miRNAs进行靶基因预测,之后采用Gene Spring12.0软件对靶基因进行GO富集分析和KEGG通路分析,以得到生物功能聚类注释信息。 5.基于生物学功能选取其中8个miRNAs,利用qRT-PCR法检测它们在20例IBS-D患者、10例IBS-C患者和10例正常对照者血清中的表达量,以对芯片筛选结果进行验证。 实验结果： 1.通过比较IBS-D组和对照组芯片检测结果,发现72个miRNAs表达差异显著,其中67个表达上调,5个下调；比较IBS-C组和对照组miRNA芯片检测结果,发现有17个miRNAs表达呈显著差异,均为表达上调；进一步比较IBS-D组和IBS-C组miRNA芯片检测结果,发现31个miRNAs差异表达显著,其中28个表达上调,3个表达下调。 2.应用TargetScan对筛选出的miRNAs进行靶基因预测,预测到IBS-D/N中的靶基因数为461个,IBS-C/N中的靶基因数为218个,而IBS-D/IBS-C中的靶基因数为357个。然后,对这三组靶基因进行G0富集分析,发现这些靶基因与离子通道(Ca2+等)调控、细胞骨架、细胞黏附、细胞膜转运、肥大细胞脱颗粒、神经递质释放或信号转导等过程相关；KEGG通路分析显示这三组靶基因分别富集于13个、7个和9个通路中(p<0.05),与细胞骨架调节、细胞因子与其受体相互作用等通路密切相关。 3.基于生物学功能选取8个miRNAs,利用qRT-PCR方法进行扩大样本量验证,结果显示：与正常对照组相比较,miR-29b-1-5p, miR-3151, miR-3158-3p, miR-4421, miR-4660, miR-4755-3p和miR-3190-3p在IBS-D患者血清中表达明显上调(p<0.05),miR-3151在IBS-C患者血清中表达明显上调(p<0.05)；而miR-4660, miR-29b-1-5p在IBS-D/IBS-C组中表达明显上调(p<0.05)；这与芯片结果表达趋势基本一致。 实验结论： 1.证实miRNAs在IBS-D和IBS-C患者体内存在差异性表达,进而表明IBS患者具有特异的miRNAs表达谱,这为进一步开展miRNAs作为IBS诊断及分型标志物的研究奠定了基础。 2.应用生物信息学方法,发现了IBS-D/N、IBS-C/N和IBS-D/IBS-C组中差异表达miRNAs的靶向基因。这些靶基因与离子通道调控、细胞骨架及细胞黏附或跨膜转运、肥大细胞颗粒、神经递质释放或信号转导等过程相关。这些生理过程可能参与了IBS的发病。因此,相关miRNAs可能在IBS发病中发挥重要的作用,其不同的表达谱可能是造成IBS亚型间存在不同临床特征的原因之一。