黄芪和三七总皂苷对2型糖尿病大血管病变的防治作用及其分子机制

随着人民生活水平的提高、生活方式的改变及人口的老龄化，糖尿病（diabetes mellitus，DM）的发病率逐年上升，目前，已成为严重威胁人类健康的重大疾病。2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）占整个糖尿病比例的90%以上。冠状动脉、大脑动脉及下肢动脉等血管病变是T2DM 病人致残、致死的主要原因。已经证明，由DM所致的大血管病变的基本病理改变与动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）基本相同，也具有脂质代谢紊乱所导致的脂质沉积和血管细胞外基质（extracellular matrix，ECM）重塑性改变。近年人们对脂质代谢紊乱与大血管病变的关系研究较多，对血管ECM重塑与血管病变的关系尚未引起足够的重视。基质金属蛋白酶-9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）是由单核/巨噬细胞和血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）合成与分泌、参与ECM降解的锌依赖性蛋白酶之一，在调节 ECM的合成和降解平衡及维持血管结构完整性方面发挥重要作用。然而，在T2DM大血管病变过程中，MMP-9的表达和活性变化以及与病变进展的关系尚不清楚。 糖尿病大血管病变的发病机制较为复杂，临床上至今尚无令人满意的防治策略。近年研究表明，中药以其多层次、多位点、整体调节的优势，可作用于大血管病变发生发展过程中的多个环节，较之针对某一病理环节的西药更有希望取得疗效。糖尿病血管病变与中医血瘀证有着共同的病理基础，本室以往对益气活血化瘀方药治疗心血管病的作用机理进行了一系列研究，证明该类方药通过诱导AS斑块内的VSMC凋亡而化解VSMC过度增殖和ECM异常积聚之“瘀”；通过调节TXA2/PGI2和t-PA/PAI-1的平衡而减轻血瘀证的病理表现。本研究以此为基础，在揭示MMP-9表达和活化与T2DM大血管病变关系的同时，应用具有益气活血作用的黄芪和三七总皂苷，从整体和分子水平探讨其防治糖尿病大血管病变的机制，以寻找中药抗AS的新靶点，为中药防治糖尿病大血管病变提供实验 依据。 1 动脉壁MMP-9表达和活性与2型糖尿病大血管病变的关系 基质金属蛋白酶家族（matrix metalloproteinases，MMPs）通过降解ECM直接参与血管壁基质的重构，在糖尿病大血管病变的发生、发展中起关键作用。本部分实验应用高脂饲料加小剂量链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）建立2型糖尿病动物模型，从整体水平动态观察2型糖尿病大鼠主动脉壁病理形态学、血糖、血脂及凝血纤溶系统的变化，探讨MMP-9表达和活化与2型糖尿病大血管病变之间的关系。实验结果如下： 1.1 糖尿病大鼠主动脉形态学变化：正常大鼠主动脉各层结构完整，内皮细胞扁平，内膜光滑、平坦。中膜VSMC排列整齐、与弹力板近似平行相间排列。成模12周末糖尿病模型组大鼠主动脉横断面上可见较多的内膜增厚病灶，其内主要由排列紊乱的增生的VSMC和泡沫细胞组成。病灶表面内皮细胞肿胀，可见脂质沉积所形成的空泡，内弹力板厚薄不均，有断裂分离现象。中膜浅层VSMC轻度增生、排列紊乱。成模12周末，对照组和模型组主动脉横断面病灶总面积与管壁总面积比率分别为0.57±0.20%和1.90±0.34%，提示糖尿病大血管病变动物模型建立成功，且病变程度较重（P<0.01）。 1.2 糖尿病大鼠主动脉壁MMP-9活性的变化：用含明胶的SDS-PAGE进行酶图分析，结果显示，糖尿病大鼠主动脉MMP-9的活性是正常大鼠的1.27倍，并且随着糖尿病病程的延长及大血管病变的发生，MMP-9活性逐渐增强，在成模4、8和12周，其活性分别是对照大鼠的1.59、2.15和2.72倍。 1.3 糖尿病大鼠主动脉壁MMP-9表达的变化：免疫组化染色显示，从对照大鼠主动脉壁中可检测到MMP-9蛋白的表达，在糖尿病大血管病变发生发展过程中，大鼠主动脉壁MMP-9的表达明显增强，12周末积分光密度值（IOD）是对照组的8.48倍。用RT-PCR对MMP-9 mRNA进行扩增的结果显示，与对照组相比较，随着病程的延长，模型组大鼠主动脉壁中MMP-9 mRNA的表达呈增高趋势，在成模0、4、8和12周，其表达水平分别是对照组的1.05、1.20、1.35和1.97倍。 1.4 血浆修饰型LDL含量的变化：对照组大鼠血浆Ox-LDL水平和 Gly-LDL指数分别是10.50±1.05 pg/dL和85.56±9.47，模型组大鼠分别为21.05±2.54 pg/dL和106.80±1.17，随着糖尿病病程的延长二者持续增加，在各时间点均显著高于对照组大鼠(P<0.01)。 1.5血液其他生化指标的改变：模型组大鼠的血糖、血浆TG、TC、VLDL-C、LDL-C均明显高于对照组大鼠(均P<0.01)，而HDL-C显著低于对照组大鼠(P<0.01)。FIB和PAI-1的水平较高，而AT-Ⅲ的水平较低。 以上结果表明，在2型糖尿病大血管病变发生过程中，伴有MMP-9表达活性和修饰型LDL及血脂含量的变化，提示MMP-9和修饰型LDL参与2型糖尿病大血管病变的发生与发展过程。 2 黄芪、三七总皂苷防治2型糖尿病大血管病变的实验研究 中医理论认为，糖尿病大血管病变属于“血瘀症”范畴，瘀血阻滞，血脉不同，心脉痹阻是其主要的病理表现。根据糖尿病大血管病变的病因病机，其治疗应以益气活血化瘀为原则。本部分实验以2型糖尿病大鼠为研究对象，从整体水平动态观察活血药三七总皂苷单用及与益气药黄芪联合应用对主动脉MMP-9表达与活性的影响及对