背景和目的
随着我国逐渐进入老龄化社会,脑血管疾病发病率不断上升,并且年轻化趋势越发凸显,人们对它的研究日益重视。急性脑血管疾病的死亡率及致残率较高,严重危害人类的健康水平和生存质量,并给家庭和社会带来了沉重的经济负担。急性缺血性脑卒中病灶由缺血中心区及其周围的缺血半暗带组成,缺血半暗带内的脑组织损伤具有可逆性,故改善缺血半暗带区域的血供对治疗和恢复神经系统功能有重要意义。细胞凋亡是脑缺血后再灌注损伤的重要机制,缺血半暗带区脑细胞凋亡是造成神经细胞不可逆损伤的原因之一。
生长相关蛋白-43（GAP-43）是神经细胞膜上一种钙离子依赖性钙调素结合蛋白,对神经的生长、发育、轴突再生以及突触功能的维持和递质的释放都起着重要作用,是神经再生、再塑的分子标志物。它与脑缺血损伤后中枢神经可塑性及机能恢复的关系是近些年来研究的热点。在神经元发育和再生过程中高水平表达,与突触的可塑性密切相关,能够调节轴突的延伸作用,改变细胞形态。它作为细胞内信号,可大大增强与G蛋白偶联的受体转运作用。
脑源性神经营养因子（BDNF）是神经营养因子（NTF）家族的重要组成成员,具有促进早期神经元增殖与分化,维持成熟神经元存活的生物学功能,能调控神经元再生的微环境、促进运动神经元的存活和生长并防止它受损及死亡。在治疗神经系统疾病方面有广泛的临床应用前景。BDNF于脑缺血早期阶段被诱发,作用于脑缺血再灌注损伤的各个环节,能从多个途径影响脑缺血再灌注后的各种变化,起到极其重要的脑保护作用。
胰岛素的生物学作用及其丰富,不仅具有促进糖原、蛋白质及脂类合成、刺激基因转录及细胞生长等作用,还可促进成骨细胞,成纤维细胞等多种细胞DNA的合成及细胞增殖。外周血液及脑内细胞均可合成,脑内广泛分布着胰岛素、胰岛素样生长因子（IGF）以及它们的受体。
本研究通过体外培养神经元,以氧糖剥夺/复糖复氧（oxygen and glucosedeprivation/reoxygenation,OGD/R）模拟急性脑缺血/再灌注损伤,观察胰岛素对细胞凋亡及GAP-43、BDNF表达的影响,进一步探讨胰岛素与神经再生、突触可塑、细胞凋亡的关系,从而了解胰岛素的神经保护作用机制,为胰岛素的临床应用及缺血性脑血管病的防治提供新的理论依据。
材料与方法
将体外培养7 d的大鼠皮质神经元随机分为A（正常对照组）、B（单纯OGD/R组）、C（胰岛素预处理组）3组。A组将培养液换为有糖earle's液,始终在37℃、5%CO2+95%O2培养箱中培养;B组进行OGD/R处理:将培养液换为无糖earle's液后,置37℃恒温的缺氧盒中,缓慢充入95%N2+5%CO2（流速1 L/min）30 min,再完全密封缺氧盒,置培养箱中培养1h后恢复无血清培养基;C组:OGD前给予终浓度1MU/L胰岛素预处理1 h。各组在复糖复氧（RO）后0 h、1h、6 h、12 h、24 h各时间点,倒置显微镜下观察各组细胞形态,MTF检测细胞活性,利用末端转移酶介导的原位缺口标记法检测神经元凋亡情况,细胞免疫组化方法检测GAP-43、BDNF的表达。
结果
1.倒置显微镜下观察各组细胞形态:A组正常7 d神经元生长活跃,胞体有折光性,立体感强,突起交织成网,形成神经细胞网络:与A组相比,B组OGD/R后细胞生长形态差,胞体变圆,突起缩短或断裂,胞体缩小变形的为凋亡细胞。随RO时间延长,损伤和凋亡细胞增多;C组胰岛素预处理后细胞损伤较轻,凋亡细胞减少。
2.MTT检测细胞活性:与A组相比,B组OGD/R后细胞存活率明显下降（RO后0-24h,P＜0.05）,随RO时间延长,存活率进一步降低。胰岛素预处理后C组细胞存活率上升,与B组相比在RO后12 h、24 h差异显著（P＜0.05）。
3.神经元凋亡的检测:A组正常神经元凋亡细胞较少,B组OGD/R后从6 h开始凋亡细胞明显多于正常对照组;C组胰岛素预处理后,6 h,12 h,24 h凋亡细胞数显著少于B组。
4.GAP-43细胞免疫组化染色:A组正常神经元胞浆中GAP-43表达较低。B组OGD/R后从6 h开始增加,随RO时间延长其表达逐渐增加,与A组相比RO后6 h、12 h、24 h,均具有显著性差异（P＜0.05）;胰岛素预处理后C组GAP-43从RO 0 h开始逐渐升高,24 h达高峰,与A、B组相比RO后0-24 h各时间点均有显著性差异（P＜0.05）。
5.BDNF细胞免疫组化染色:A组正常神经元中BDNF表达极低;B组OGD/R后1 h其表达开始增加,且随RO时间延长其表达逐渐增加,与A组相比差异显著（P＜0.05）;C组胰岛素预处理BDNF表达较B组明显增加,各时间点均差异显著（P＜0.05）。
结论
1.缺血再灌注损伤后大鼠皮层神经元细胞存活率下降,出现大量凋亡细胞,GAP-43、BDNF表达少量增加。
2.胰岛素能够减轻缺血再灌注对大鼠皮层神经元细胞的损伤,抑制凋亡细胞的产生。
3.胰岛素可能通过上调GAP-43、BDNF蛋白在神经元中的表达而起到促进突触再生、抑制细胞凋亡的保护作用。
