乌头碱降解产物化学成分及生物活性研究

毛莨科(Ranunculaceae)乌头属(Aconitum L.)植物为多年生、二年生或一年生草本,全世界约有300多种,主要分布于北半球的高海拔地区。我国乌头属植物超过200种,除海南外各省均有分布,我国已有76种乌头属植物被应用于中药处方中,该属植物的根和块茎普遍地应用于治疗多种疾病,例如阳虚汗出,昏厥,风湿热,关节疼痛,肠胃炎,痢疾,水肿,支气管哮喘,肿瘤,以及一些内分泌紊乱引起的疾病如月经不调等。 乌头属植物主要含有生物碱、黄酮和多糖类成分。国内外学者已从乌头属植物中分离鉴定了400多种生物碱类化合物,主要为二萜类生物碱,其中普遍存在且含量较高的是乌头碱、新乌头碱和次乌头碱。研究结果显示,这三种生物碱是乌头属植物中主要的药效成分,具有抗炎、镇痛等活性。同时这三种生物碱也是毒性成分。文献指出这三种双酯型生物碱易发生水解,生成单酯型乌头碱和乌头原碱,单酯型乌头碱仍具有抗炎镇痛活性,但毒性大大降低。 有关单酯型乌头碱活性的报道比较少,为了进一步研究单酯型乌头碱单体的活性,本文对附子中主要的双酯型乌头碱进行了提取、分离和鉴定,得到四个化合物,利用1D NMR、MS和IR等波谱学手段确定了它们的结构。分别为脱氧乌头碱(deoxyaconitine)、次乌头碱(hypaconitine)、乌头碱(aconitine)和新乌头碱(mesaconitine)。 将上述四种双酯型乌头碱水解,共得到11个化合物,利用1D NMR、2D NMR、MS和IR等波谱学手段鉴定了它们的化学结构,其中包括四种单酯型乌头碱分别为苯甲酰乌头碱(benzoylaconine)、苯甲酰新乌头碱(benzoylmesaconine).苯甲酰次乌头碱(benzoylhypaconine)和苯甲酰脱氧乌头碱(benzoyldeoxyaconine);三种乌头原碱分别为乌头原碱(aconine)、新乌头原碱(mesaconine)、次乌头原碱(hypaconine);四种焦乌头碱分别为焦乌头碱(pyroaconitine)、焦新乌头碱(pyromesaconitine)、焦次乌头碱(pyrohypaconitine)和焦脱氧乌头碱(pyrodeoxyaconitine)。另外,本文还对苯甲酰次乌头碱、乌头原碱、新乌头原碱和次乌头原碱、焦乌头碱、焦新乌头碱、焦次乌头碱的1H和13C化学位移进行了全归属,纠正了原有文献对苯甲酰乌头碱和苯甲酰新乌头碱的归属错误。 本论文应用反相高效液相色谱法,使用Agilent Zorbax Eclipse plus-C18 (5μm,250 mm X 4.60 mm),流动相为甲醇(A)和水(包含5mmol/L的醋酸铵和0.2%的乙酸)(B)(A：B=40：60),流速1.0 mL/min,检测波长为235 nm,柱温35℃,对制草乌中新乌头碱,乌头碱,次乌头碱,苯甲酰新乌头碱,苯甲酰乌头碱和苯甲酰次乌头碱进行了含量测定。结果显示：六种化合物进样量在0.01～10.00μg范围内均有良好的线性关系,相关系数r均在0.9995以上(n=8)；有很好的稳定性,测定重复性的RSD值均在1.84-3.17%之间；平均回收率(n=6)在96.83%-104.73%之间,RSD值均小于2.61%,本方法能够准确测定制草乌中的6种生物碱的含量,为草乌类药材的质量控制提供了依据。 本文还建立了一种新的提取生物碱的方法,即基质固相分散法(MSPD),并对MSPD法影响提取率的几个因素如分散剂、洗脱剂、物料比、净化剂、助溶剂和洗脱体积等条件进行了优化。当采用碱性氧化铝为分散剂、样品与分散剂比为1：2、80%的乙腈水溶液(pH=12)作为洗脱剂和洗脱体积为10 mL,由MSPD法提取的新乌头碱、次乌头碱、乌头碱和脱氧乌头碱的提取率分别为2214.44,1769.55,1299.28,275.40μg g-1,各化合物含量的RSD值均小于1.20%,而由回流法得到的四种生物碱的提取率分别为1949.08,1239.75,1152.61,149.03μg g-1,由此可见,MSPD法的提取率较高,且四种生物碱的回收率都在93.16-102.73%之间,回收率良好。此外,MSPD法还具有提取时间短、操作步骤简单、溶剂用量少的优点,因此MSPD法更适合提取提取乌头类药材中生物碱类化合物。 本文还研究了三种单酯型乌头碱对大鼠佐剂性关节炎的作用。结果显示,苯甲酰乌头碱、苯甲酰新乌头碱和苯甲酰次乌头碱均能降低大鼠原发性和继发性足肿胀率,能够明显降低佐剂性关节炎大鼠血沉和白细胞数量,降低MDA含量,升高SOD活性。