小檗碱通过靶向AKR1C3抑制去势抵抗性前列腺癌细胞生长的作用及机制研究

雄激素和雄激素受体（androgen receptor,AR）通路激活在前列腺癌的发生、发展中具有重要作用。因此，以降低血清雄激素水平和拮抗AR受体为目的的雄激素剥夺疗法（androgen deprivation therapy, ADT）一直是治疗进展期前列腺癌及其转移癌的经典方法，但经过12～18个月的ADT后，超过80%的患者不可避免地发展为去势抵抗性前列腺癌（castration-resistant prostate cancer, CRPC），一旦进展为CRPC，患者生存期不超过2年。因此，探索CRPC的发生机制，寻找疗效可靠的药物阻止前列腺癌向CRPC进展及有效治疗CRPC具有重大的理论和现实意义。 最近研究表明，前列腺癌细胞自身获得以胆固醇为原料从头合成雄激素的能力，以及肿瘤利用肾上腺来源的雄激素前体转化为雄激素是前列腺癌进展为CRPC的关键因素。因此，阻断肿瘤细胞内的雄激素合成，尤其是抑制雄激素合成通路中的关键酶成为治疗CRPC的新思路。醛-酮还原酶1C家族3（aldo-ketoreductase1C family3, AKR1C3）属于醛-酮还原酶家族，是前列腺癌细胞雄激素合成通路中催化低生物活性雄烯二酮（△4-adione）和雄酮为高活性睾酮（T）和双氢睾酮（DHT）最后两个步骤的关键酶。研究表明，AKR1C3在正常前列腺上皮细胞、基质细胞和内皮细胞呈弱阳性或阴性表达，在前列腺癌上皮细胞呈强阳性表达，在去势治疗后的前列腺癌组织中，AKR1C3的过表达具有普遍性。此外，稳定转染AKR1C3的LNCaP细胞倾向于生成大量T而非DHT，AKR1C3表达增加与雄激素水平降低、去雄激素培养后前列腺癌细的干细胞转化密切相关，提示AKR1C3过表达可能是前列腺癌由激素依赖性向CRPC转化以及前列腺癌样干细胞调控肿瘤复发的适应性改变。因此，将AKR1C3作为防治CRPC的新靶标，寻求AKR1C3的特异性抑制剂，减少前列腺癌细胞中雄激素的合成，可能是预防和治疗CRPC的新策略。 小檗碱(Berberine, BBR)是从黄连和黄柏等中药中提取的异喹啉生物碱，具有抗炎、调节免疫和抗恶性肿瘤等药理作用。近年来研究发现，BBR对前列腺癌具有良好的抑制作用，但其对CRPC的防治作用和机制鲜有报导。我们的前期工作显示：BBR可延长去势裸鼠LNCaP细胞皮下移植瘤进展为CRPC的潜伏期，缩小CRPC的肿瘤体积。 基于上述研究背景，我们提出以下问题： 1. AKR1C3在良恶性前列腺组织的表达是否有差异？AKR1C3与血清PSA和前列腺癌Gleason评分（GS）是否有关？AKR1C3在前列腺癌向CRPC进展过程中扮演什么角色？ 2. AKR1C3在不同前列腺癌细胞株中的表达情况怎样？BBR能否抑制AKR1C3高表达细胞株增殖？能否减少AKR1C3高表达细胞中的睾酮含量？如果可以，其机制是否与AKR1C3有关？如果有关，其抑制AKR1C3的机制是什么？ 为了回答上述问题，本课题进行了以下三个方面的研究： 1. AKR1C3在前列腺癌组织中的表达及其与前列腺癌进展的关系研究 （1）AKR1C3在前列腺癌组织的表达：以临床前列腺增生（BPH）组织、前列腺内皮腺瘤（PIN）组织、前列腺癌（PCa）组织穿刺标本为研究对象，采用免疫组织化学方法检测AKR1C3的表达情况。研究结果显示，AKR1C3在良、恶性前列腺标本中的均有表达，在BPH和PIN穿刺组织中，AKR1C3阳性染色主要集中于基质细胞，而在PCa穿刺样本中AKR1C3阳性染色主要集中于癌变的腺上皮细胞，而且在GS≥6的PCa中，其染色强度随GS的增加而逐渐增强。提示AKR1C3表达水平与前列腺癌的进展密切相关。 （2）AKR1C3与Gleason评分（GS）、PSA和年龄的相关性：GS、PSA和年龄是前列腺癌的重要参考指标，本研究对上述三个指标与AKR1C3蛋白表达之间的相关性进行了分析。结果显示，在GS≥6的PCa穿刺样本中，AKR1C3与GS呈正相关（rs=0.396, P=0.025）；在BPH穿刺标本中，AKR1C3与血清PSA水平无相关性（rs=-0.016, P=0.979），但是在PCa穿刺样本中，AKR1C3与血清PSA水平呈负相关（rs=-0.377, P=0.036）；AKR1C3与前列腺增生患者的年龄呈正相关（rs=0.76, P=0.01），前列腺癌组织。提示对于高GS，低血清PSA前列腺癌患者，AKR1C3过表达可能是PCa向CRPC转变的重要生物学标记。 （3）AKR1C3在去势小鼠种植瘤模型肿瘤组织中的表达：采用去势LNCaP裸鼠原位种植瘤模型，研究AKR1C3的表达对去势抵抗性前列腺癌形成的影响。结果表明，去势3周后种植瘤组织AKR1C3阳性染色细胞明显高于对照组，提示去除血循环中的雄激素后，细胞通过应激性激活AKR1C3基因并诱发AKR1C3蛋白表达上调，最终促进前列腺癌向CRPC进展。 2. BBR通过靶向AKR1C3抑制体外培养去势抵抗性前列腺癌细胞株CWR22RV1生长及其机制研究 （1）AKR1C3高表达前列腺癌细胞株的筛选：Western blot法筛选AKR1C3高表达的前列腺癌细胞株。结果表明，在5株前列腺癌细胞（LNCaP细胞、CWR22RV1细胞、C4-2B细胞、PC3细胞和PC3M细胞）中，PC3M和CWR22RV1细胞中AKR1C3的表达量较高，其中CWR22RV1是公认的去势抵抗性前列腺癌细胞。 （2）BBR对CWR22RV1细胞的增殖抑制作用：通过MTT法检测12.5μM、25μM和50μM的BBR，30μM吲哚美辛（INN）和2μM非那雄胺（finasteride）作用48h后对CWR22RV1细胞的影响。结果表明，BBR能以剂量依赖性方式抑制抑制CWR22RV1细胞增殖，此抑制效应因添加AKR1C3的激素底物△4-adione而被部分削弱，提示BBR可能通过抑制AKR1C3进而抑制细胞增殖。 （3）BBR对CWR22RV1细胞睾酮生成的影响：先用非那雄胺抑制5α-还原酶，阻止△4-Adione代谢为雄烷二酮（5α-dione）或T代谢为DHT，然后向细胞培养液中添加睾酮前体△4-adione，BBR或INN。结果表明，25μM BBR作用48h可明显降低培养液上清中睾酮含量，其抑制效果强于经典的AKR1C3抑制剂INN。 （4）BBR对CWR22RV1细胞AKR1C3mRNA和蛋白的影响：25μM BBR处理CWR22RV1细胞48h，提取细胞总mRNA和总蛋白，通过RT-PCR和Westernblot方法观察BBR对AKR1C3转录与表达的影响。结果表明，无论是mRNA水平还是蛋白水平BBR对CWR22RV1细胞AKR1C3的表达均未见明显影响。 （5）重组酶活性水平研究BBR对AKR1C3的抑制作用：建立AKR1C3酶促反应体系，以四氢萘酚为底物检测BBR对AKR1C3氧化酶活性的影响，以△4-adione为底物检测BBR对AKR1C3还原酶活性的影响。结果表明，BBR可抑制重组人AKR1C3的酶活性，以四氢萘酚为底物时其抑制AKR1C3的IC50值为1.69μM，以△4-adione为底物时其抑制AKR1C3的IC50值为3.60μM。同样，分别以四氢萘酚和△4-adione为底物时，INN抑制AKR1C3的IC50值分别为7.07μM和11.42μM，提示在相同剂量下，AKR1C3的氧化酶活性更易受抑制剂的影响。 3.通过分子模拟技术研究BBR抑制AKR1C3酶活性的分子机制 （1）BBR与AKR1C3酶活性中心的分子对接：采用AutoDock Tool分子模拟软件，将BBR与AKR1C3酶活性中心进行分子对接。结果显示，BBR可与AKR1C3活性中心SP1和SP2亚口袋处Phe306和Phe311氨基酸残基以Pi-Pi共轭方式相互作用，并占据AKR1C3活性中心通道。 （2）BBR与AKR1C3生理性底物的结合自由能比较：采用AutoDock Tool分子模拟软件，将AKR1C3生理性底物与酶活性中心进行分子对接。结果显示，BBR与AKR1C3的亲和力略高于睾酮、雄烷二酮、雄烷二醇等底物，略低于脱氢表雄酮、雄烯二酮和与DHT等底物，雄烯二酮对AKR1C3的结合自由能最低，推测生理条件下AKR1C3对雄烯二酮的选择性更高。 综合以上研究结果，本课题得出以下结论： 1. AKR1C3过表达是前列腺癌进展过程中的适应性反应，可能成为前列腺癌向CRPC进展的生物学靶标。 2. BBR通过靶向抑制AKR1C3酶活性，减少细胞内睾酮含量，抑制CRPC细胞CWR22RV1的增殖。 3.分子模拟技术首次揭示BBR抑制AKR1C3酶活性的结构基础：与AKR1C3活性中心SP1和SP2亚口袋处Phe306和Phe311氨基酸残基发生Pi-Pi相互作用，并占据AKR1C3活性中心通道，进而降低AKR1C3对底物的催化能力。