目的腹泻型肠易激综合征(diarrhea-predominant irritable bowel syndrome,IBS-D)是以反复发作的腹胀痛、腹泻为主要症状的慢性肠病,属于中医脾虚泄泻的范畴。目前认为IBS-D是社会环境、心理、肠道、遗传等多因素综合作用的结果,IBS-D的发生发展与其免疫功能紊乱密切相关;最新的研究提示干细胞因子/酪氨酸激酶受体(Stem cell factor/C-kit,SCF/C-kit)信号是IBS-D免疫系统功能紊乱的重要调节信号。课题组前期研究初步发现,疏肝健脾止泻方肠激安治疗IBS-D疗效确切,对其免疫系统有一定的影响,但深入的作用机制有待进一步探索。本课题拟通过动物实验和细胞实验的相互验证,进一步探索肠激安方对IBS-D免疫功能的影响以及SCF/C-kit系统的调控作用:通过动物实验,探索干细胞因子/酪氨酸激酶受体(stem cell factor/C-kit,SCF/C-kit)信号与腹泻型肠易激综合征(IBS-D)大鼠免疫系统紊乱的关系及肠激安方的调控作用:观察肠激安方对IBS-D大鼠内脏高敏感性及肝郁脾虚症状的改善作用;检测IBS-D的免疫指标的变化,分析肠激安方对IBS-D大鼠免疫系统的影响;观察肠激安方对IBS-D大鼠SCF/C-kit系统的干预作用;统计学分析IBS-D大鼠SCF/C-kit信号与其内脏高敏感性及免疫指标的相关性。通过细胞实验,进一步探索SCF/C-kit信号对肠上皮细胞生物学功能的影响及肠激安方的改善作用:通过激活或阻断SCF/C-kit信号和制备IEC-6损伤细胞模型相互验证的方法,探索SCF/C-kit信号在肠上皮细胞生物学功能中的作用;观察肠激安方对LPS诱导的细胞损伤模型中SCF/C-kit信号的影响及相关免疫指标的变化,揭示肠激安方保护肠道上皮屏障功能的作用机理。方法一、SCF/C-kit信号与腹泻型肠易激综合征(IBS-D)大鼠免疫系统紊乱的关系及肠激安方的调控作用(一)通过母婴分离、醋酸刺激、束缚应激三因素法制备肝郁脾虚型IBS-D大鼠模型;造模成功后将大鼠随机分为模型对照组、匹维溴铵组(0.018 g·kg-1)、疏肝健脾中药肠激安高(33.48 g·kg-1)、中(16.74g·kg-1)、低剂量组(8.37g·kg-1),每组6只,连续灌胃14d,另取同批次正常大鼠6只作为对照,同法给予生理盐水。给药结束后考察大鼠体重、日进食量、糖水偏好、自主活动行为学特征,并通过直肠扩张实验评估其内脏敏感性,通过HE染色考察其病理特征。(二)取正常SD大鼠采用三因素法制造IBS-D模型,造模成功后将大鼠随机分为模型对照组、匹维溴铵组、中药肠激安高、中、低剂量组,每组6只,连续灌胃14 d,另取同批次正常大鼠6只作为对照,同法给予生理盐水。给药结束后测定各组大鼠的胸腺系数和脾系数,电镜观察肠道上皮细胞的形态学变化,免疫组化法检测ICAM-1、Akt的原位表达;ELISA法检测血清中类胰蛋白酶、TNF-α、IL-8和IL-10的含量,实时荧光定量PCR法检测结肠中TNF-α、IL-1β、NF-κB、Claudin1的mRNA表达。(三)取新生SD大鼠,采用三因素法制造IBS-D模型,造模成功后随机分为模型组和中药治疗组各6只;另取6只正常大鼠作为对照组。给药剂量同(一),模型组和正常组同法给予生理盐水。给药结束后处死动物,取结肠,免疫组化法检测结肠中SCF和C-kit蛋白表达,Q-PCR法检测结肠SCF和C-kit基因表达,Western Blot法检测结肠组织中SCF、C-kit的蛋白表达。(四)用单样本K-S检验分析各指标数据的正态性;对于符合双变量正态分布的数据资料,采用积矩相关系数(Pearson相关系数);对于非双变量正态分布的数据资料,选用等级相关系数(Spearman相关系数),分析SCF、C-kit的表达和内脏敏感性及免疫学指标的关系。二、SCF/C-kit信号对肠上皮细胞生物学功能的影响及肠激安方的改善作用(一)培养大鼠肠道隐窝上皮细胞IEC-6,通过以下四种方式干预:(1)通过外源性给予SCF:RTCA法观察细胞的增殖情况;显微镜观察细胞形态变化;Q-PCR法检测Claudin1、NF-κB、Akt基因表达(2)给予抑制剂STI-571:RTCA法观察细胞的增殖作用;显微镜观察细胞形态变化;IF法检测STI-571对IEC-6 NF-κB蛋白表达的影响;Q-PCR法检测 STI-571 对 IEC-6 Akt、NF-κB、Claudin1、CLaudin2 的影响(3)LPS制备细胞损伤模型:RTCA法观察细胞的增殖作用;免疫荧光法检测LPS对IEC-6 NF-κB、C-kit蛋白表达的影响;Q-PCR法检测损伤模型中SCF、C-kit、NF-κB、Claudin1、Claudin2 的 mRNA 的表达。(4)TNF-α制备损伤模型:Q-PCR法检测 SCF、C-kit、NF-κB、Claudin1、Claudin2 的 mRNA 的表达。(二)LPS制造IEC-6细胞损伤模型,RTCA筛选出合适肠激安方药物的浓度,选择最优三个剂量作为高、中、低剂量组进行细胞干预,通过免疫组化法和免疫荧光法考察细胞SCF和C-kit及NF-κB表达,Q-PCR方法考察SCF、C-kit及NF-κB、Claudin1、Claudin2 的基因表达。结果一、SCF/C-kit信号与腹泻型肠易激综合征(IBS-D)大鼠免疫系统紊乱的关系及肠激安方的调控作用(一)和正常组相比,模型大鼠的结肠粘膜无明显的间质水肿、体重降低(P<0.01),内脏敏感性评分升高(P<0.01),日均进食量、糖水偏好百分比及自主活动均降低(P<0.05)。和模型组比,匹维溴铵组、肠激安高剂量、中剂量组的体重都明显回升(P<0.01),内脏敏感性评分明显降低(P<0.01),低剂量无效(P>0.05);匹维溴铵组、肠激安高剂量、中、低剂量的日均进食量、糖水偏好百分比及自主活动均明显回升(P<0.05)。(二)和正常组相比,模型大鼠的胸腺系数和脾系数明显增高(P<0.05);上皮细胞整体形态无明显变化,但是细胞器出现异常;血清中IL-8、TNF-α和类胰蛋白酶含量升高(P<0.05)、IL-10含量降低(P<0.01);ICAM-1和Akt的原位表达无明显差异;TNF-α、IL-1β 和 NF-κB 的 mRNA 表达均升高(P<0.05,P<0.01,P<0.05),Claudin1的mRNA表达显著降低(P<0.05)。和模型组相比,各给药组的胸腺系数明显下降(P<0.01),脾系数有下降趋势,但无统计学差异(P>0.05);匹维溴铵和肠激安高、中剂量对线粒体和粗面内质网异常等有一定的改善作用;各给药组的IL-10的含量均升高,差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01,P<0.01,P<0.01,);匹维溴铵组、肠激安高、中剂量组的TNF-α均降低(P<0.05,P<0.01,P<0.05);肠激安中、低剂量组的类胰蛋白酶显著降低(P<0.05,P<0.01);各给药组的TNF-α的mRNA表达均显著降低(P<0.05);匹维溴铵和肠激安高、中剂量组的IL-1β的mRNA表达显著降低(P<0.01,P<0.01,P<0.05),低剂量组有降低趋势,但无统计学差异(P>0.05);匹维溴铵和肠激安高、中剂量组的NF-κB的mRNA表达显著降低(P<0.01),低剂量组有降低趋势,但无统计学差异(P>0.05);各组Claudin1的mRNA表达有升高趋势,但无统计学差异(P>0.05)。(三)和正常组比SCF和C-kit的阳性表达有所减弱;SCF和C-kit的蛋白相对表达量均明显下降(P<0.01);SCF和C-kit的mRNA表达量均显著降低(P<0.01)。和模型组比,匹维溴铵组SCF阳性表达率有所增强;SCF和C-kit蛋白相对表达量均无明显差异(P>0.05);SCF和C-kit的mRNA均显著升高(P<0.05);肠激安方高剂量的SCF和C-kit的阳性表达有所增强;肠激安高剂量和低剂量组的SCF蛋白相对表达均降低(P<0.01,P<0.05),肠激安中剂量的C-kit的相对表达量显著下降(P<0.01);肠激安高剂量组的结肠SCF的mRNA表达量显著升高(P<0.01)其他组无显著差异(P>0.05)。(四)SCF的表达与内脏敏感性呈负相关(P<0.01),SCF的表达与脾系数呈负相关(P<0.01),C-kit的表达与胸腺系数和脾系数呈负相关(P<0.01),SCF的表达TNF-α、IL-8 呈负相关(P<0.01,P<0.05),与 IL-10 呈正相关(P<0.05),和 C-kit的表达与TNF-α呈负相关(P<0.05),SCF、C-kit的的表达与NF-κB和Claudin1的表达无相关(P>0.05)。二、SCF/C-kit信号对肠上皮细胞生物学功能的影响及肠激安方的改善作用(一)(1)不同浓度的SCF作用于IEC-6不同的时间,对细胞的生物学功能均无影响。(2)不同浓度的STI-571刺激IEC-64小时,细胞的形态受到不同程度的破坏,并呈浓度依赖;不同浓度(100、50、25、12.5、6、3、1.5μmol/L)的STI-571对细胞的生殖情况产生不同程度的抑制作用,其中以100μmol/L和50μmol/L最为明显;不同浓度的STI-571干预IEC-6以后,NF-κB的荧光强度明显减弱,以50μmol/L最为明显;50μmol/L 和 100μmol/L 抑制时,IEC-6NF-κB 的 mRNA 表达明显升高(P<0.05,P<0.01),Claudin1明显降低(P<0.05,P<0.01),各浓度的STI-571抑制时,Akt和 CLaudin2 的 mRNA表达无统计学差异(P>0.05)。(3)不同浓度(10Oμg/ml、50μg/ml、25μg/ml)的LPS对细胞的增殖均产生了抑制作用,并呈浓度依赖;IEC-6没有SCF的表达;LPS诱导时,在50μg/ml和100μg/ml时,IEC-6的NF-κB表达增强,C-kit表达减弱,并成浓度依赖;和正常组比,TNF-α诱导的制备IEC-6损伤模型,在刺激1h 时,NF-κB 的 mRNA 表达明显升高(P<0.01),而 SCF、C-kit、Claudin1、Claudin2的mRNA表达均无统计学差异(P>0.05)。(4)和正常组比,TNF-α诱导的制备IEC-6损伤模型,在刺激1h时,NF-κB的mRNA表达明显升高(P<0.01),而SCF、C-kit、Claudin1、Claudin2的mRNA表达均无统计学差异(P>0.05)。(二)肠激安高剂量组能够增加LPS诱导的炎症细胞模型中C-kit和NF-κB的蛋白表达,具有一定的调控作用,高剂量组能够增加炎症细胞模型中SCF、C-kit、Claudin1的 mRNA 表达(P<0.01,P<0.05,P<0.01),降低 NF-κB 的 mRNA 表达(P<0.01);中剂量组能够增加SCF、Claudin1的mRNA表达(P<0.05)、降低NF-κB、Claudin2的mRNA表达(P<0.05);低剂量能够降低NF-κB和Claudin2的mRNA表达(P<0.05,P<0.01)。结论(一)证明“三因素法”制备的大鼠模型符合肝郁脾虚型IBS-D的特征,疏肝健脾法对其内脏高敏感性和肝郁脾虚症状具有改善作用。(二)IBS-D大鼠免疫器官和免疫细胞结构发生了改变,并出现炎症因子的失衡现象和细胞结构蛋白的异常变化;疏肝健脾法能够一定程度地改善IBS-D大鼠免疫器官和免疫细胞的功能,并能够调节炎症因子的表达和一定程度地改善上皮细胞结构蛋白的表达,这可能是其治疗IBS-D的作用途径之一。(三)肠激安方对能够增强IBS-D结肠组织中SCF和C-kit的基因和蛋白表达,提示肠激安方对SCF/C-kit信号有一定的调控作用。IBS-D大鼠的SCF/C-kit信号的变化与其内脏高敏感性及免疫失调具有一定程度的相关性。(四)肠激安方对LPS损伤的IEC-6细胞SCF/C-kit信号有一定的调控作用,同时能够一定程度地降低NF-κB和Claudin2的表达,上调Claudin1的表达。
