疏肝健脾止泻复方中药对IBS-D模型大鼠神经—内分泌—免疫网络的调控机制研究

本研究为国家自然科学基金：疏肝健脾止泻法对IBS-D'‘脑-肠轴异常”的调控机制研究(NO.81073160)和广东省自然科学基金：疏肝健脾法调控FBD (-IBS)大鼠“脑-肠轴异常通路”中的差异表达蛋白特征性研究(NO.1015104701000041)的部分研究内容。课题组前期建立了具有内脏超敏化、腹泻症状明显的IBS-D大鼠模型,并开发研制了具有疏肝健脾、清热利湿、止泻、止痛功效的肠激安胶囊(专利号：ZL201110075802.5),初步分析了疏肝健脾止泻法在IBS-D“脑-肠轴异常”中的作用机制。本研究在前期研究基础上进一步完善IBS-D模型大鼠的造模方法和评价体系,并对其中医证候属性进行分析；考察疏肝健脾止泻复方中药肠激安胶囊对IBS-D神经-内分泌-免疫网络系统的调控作用。第一部分：肝郁脾虚型IBS-D动物模型建立和评价体系的完善目的：参考国内外的文献中关于IBS-D的造模方法,建立一种病-证-症结合的IBS-D动物模型,并完善其评价体系,判断其中医证候属性。方法：(1)以“腹泻型肠易激综合征”、"IBS-D"、“动物模型”等为检索词,查找相关文献,并进行文献质量评价、数据提取和分析,考察国内外IBS-D模型动物种属和性别选择情况及模型建立方法,筛选最佳的实验动物、动物性别和造模方法；(2)在前期研究基础上,以母婴分离、束缚应激和直肠醋酸刺激三因素联合建立IBS-D大鼠模型,以Bristol分型积分和粪便含水量、内脏敏感性和肠组织形态评价其病症特点,以一般行为学评分、糖水偏好百分比、悬尾不动时间、日均进食量、脾系数和胸腺系数评价其证候特征；(3)根据“以方测证”原理,将成功的IBS-D模型随机分为四逆散组、痛泻要方组、肠激安方组和模型对照组,另取正常大鼠作为空白对照,分别采用四逆散、痛泻要方和肠激安胶囊对IBS-D模型大鼠进行干预和治疗,模型对照组和正常组同法给予生理盐水,考察一般行为学评分、糖水偏好百分比、悬尾不动时间、日均进食量、脾系数和胸腺系数等指标的变化差异,判断所建立的IBS-D模型大鼠的中医证候属性。结果：(1)国内外研究中,建立IBS-D动物模型的研究对象以SD雄性乳鼠最优,宜优先选择化学试剂刺激、束缚应激结合母婴分离法复合造模；(2)所建立的新模型组和原模型组IBS-D大鼠的粪便Bristol分型积分、粪便含水量较正常组均显著升高(aP<0.05),且新模型组造模结束后10天粪便积分值和含水量均显著高于原模型组(bP<0.05),造模结束10天波动较小；而肠道敏感性均较正常组显著降低(aP<0.05),脾脏系数和胸腺系数显著增加(aP<0.05),且新模型组和原模型组之间无显著差异(bP>0.05)；正常组、新模型组和原模型组大鼠的回肠、直肠组织形态结构完整,未见异常病变,而新模型组和原模型组大鼠结肠组织出现轻微充血和中性粒细胞浸润；新模型组和原模型组大鼠的行为学综合得分、日均进食量和糖水偏好百分比较正常组显著降低(aP<0.05),悬尾不动时间显著延长(aP<0.05)；而与原模型组比较,新模型组的行为学综合得分值显著下降(bP<0.05),糖水偏好百分比显著升高(bP<0.05),悬尾不动时间和日均进食量无显著差异(bP>0.05)；(3)给予四逆散后,IBS-D大鼠行为学综合得分、日均进食量、糖水偏好百分比均显著增加(bP<0.05),悬尾不动时间和胸腺系数均显著降低(bP<0.05)；给予痛泻要方后,IBS-D大鼠行为学综合得分、日均进食量均显著增加(bP<0.05),悬尾不动时间和胸腺系数均显著降低(bP<0.05),糖水偏好百分比无显著差异(bP>0.05)；给予肠激安胶囊后,IBS-D大鼠行为学综合得分、日均进食量、糖水偏好百分比均显著增加(bP<0.05),悬尾不动时间和胸腺系数均显著降低(bP<0.05)；所有干预方药均对脾脏系数无显著影响(bP>0.05)。结论：(1)采用早期母婴分离、束缚应激和直肠醋酸刺激法可建立IBS-D大鼠模型,且该模型属于中医肝郁脾虚证候范畴；(2)所建立的IBS-D模型具有内脏敏感性升高、腹泻、抑郁、免疫功能亢进的特点,且其结肠组织存在低度炎症；(3)Bristol粪便分型积分和内脏敏感性可作为判断该模型是否成功的重要依据。第二部分：疏肝健脾止泻复方中药干预IBS-D大鼠氨基酸类神经递质机理研究目的：建立微透析在体采样-高效液相(high-performance liquid chromatography,HPLC)联用测定脑局部氨基酸类神经递质含量的方法,并探讨兴奋性氨基酸类神经递质谷氨酸(glutamic acid,Glu)和抑制性氨基酸Y-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,γ-GABA)在IBS-D中的发病机制及疏肝健脾止泻复方中药干预IBS-D的作用机理。方法：(1)以C18色谱柱,甲醇-0.1mol/L醋酸钠缓冲液(pH=6.9)为流动相进行梯度洗脱,柱温25℃；激发波长λex=357nm,发射波长λ.em=455nm,进样量10μL为色谱条件,建立氨基酸类神经递质OPA衍生-荧光高效液相色谱含量测定方法；(2)以微透析探针的体外相对回收率和稳定性为指标,筛选最佳的灌流速度、灌流液温度、样品浓度,并以体内相对损失率及其稳定性为指标,对所建立的微透析采样技术进行验证和校正；(3)将IBS-D模型大鼠随机分为肠激安高、中、低剂量组、匹维溴铵组和模型对照组,另取正常大鼠作为空白对照,分别给予相应药物干预治疗,采用活体脑微透析采样-HPLC联用技术测定各组大鼠给药后第1、3、7、11、14、21、28天的脑内氨基酸类神经递质含量。结果：(1)Asp、Glu、Tau和γ-GABA的峰形完整,分离度良好,精密度、稳定性和准确度均符合方法学测定要求；(2)Glu和,γ-GABA最佳的微透析实验条件为以37℃人工脑脊液作为灌流液,灌流速度为0.8μL/min,采样间隔为30min；其脑微透析校正值分别为0.3439和0.2732；(3)与空白对照组比较,IBS-D大鼠海马组织中y-GABA的含量显著升高(aP<0.05),给予肠激安胶囊和匹维溴铵后其含量显著下降(bP<0.05),且肠激安胶囊存在一定的浓度依赖性；Glu的含量也显著升高(aP<0.05),给予肠激安胶囊其含量显著下降(bP<0.05),但给予匹维溴铵其含量无明显变化(bP>0.05)；而Glu/y-GABA水平显著低于空白对照组(aP<0.05),给予高剂量和中剂量肠激安胶囊后,其水平呈持续升高趋势(bP<0.05),并逐渐恢复至正常水平(aP>0.05),低剂量肠激安胶囊对该平衡无明显的影响(▲P>0.05)。结论：中枢神经系统兴奋性氨基酸Glu和抑制性氨基酸y-GABA的比例失调可能是IBS-D发生的重要机制之一,其表现该平衡向抑制性氨基酸类神经递质方向偏移,导致机体出现抑郁状态；疏肝健脾止泻复方中药干预中枢神经系统的作用机制可能与调节Glu/y-GABA水平使之恢复平衡状态有关。第三部分：疏肝健脾止泻复方中药对IBS-D大鼠的内分泌及体液调节机制研究目的：探讨内分泌系统相关的激素5-HT、DA、ACTH、CORT及5-HT3受体、CCK-8和体液相关的电解质Na+、Ca2+、K+和Cl-在IBS-D发病中的机制及疏肝健脾止泻复方中药对上述指标的影响。方法：(1)以肝郁脾虚型IBS-D大鼠为研究对象,随机分为肠激安高、中、低剂量组、匹维溴铵组和模型对照组,另取正常大鼠作为空白对照,给予相应药物干预后,采用ELISA法检测各组大鼠血清中5-HTDA、ACTH和CORT的含量,采用离子选择性电极法测定Na+,采用邻甲酚酞络合酮比色法测定Ca2+,采用比浊法测定K+、Cl-的含量。(2)剥离各组大鼠海马组织和结肠组织,采用免疫组织化学染色法,观察5-HT3受体和CCK-8阳性表达情况,并用MetaMorph图像分析软件测定其光密度值(IOD),并对海马-结肠组织的IOD值进行线性分析。结果：(1)与空白对照组比较,IBS-D模型大鼠血清中5-HT、DA、ACTH和CORT含量均显著升高(aP<0.05),给予高、中剂量肠激安胶囊和匹维溴铵后,血清中5-HT、DA、ACTH和CORT含量均显著下降(bP<0.05),而低剂量肠激安胶囊对5-HT、ACTH和CORT无明显影响(bP>0.05),能显著下调DA的释放(bP<0.05)；与空白对照组比较,IBS-D模型大鼠血清中Na+、Ca2+和K+含量均显著降低(aP<0.05),Cl-的含量无明显变化(aP>0.05); IBS-D模型大鼠给予高、中剂量肠激安胶囊后,血清中Na+、K+和C1-的含量均显著升高(bP<0.05),低剂量肠激安胶囊可显著提高K+和Cl-的含量(bP<0.05),而匹维溴铵对IBS-D大鼠血清中Na+和Cl-的含量无影响(bP>0.05),肠激安胶囊对血清Ca2+含量无影响(bP>0.05)；(2)所有切片中均可见5-HT3受体、CCK-8阳性表达的细胞,胞浆中可见黄色或棕黄色颗粒。各组大鼠结肠组织形态完整,未见异常病变,而模型组海马组织细胞核固缩,浓染,出现核偏位,结构层次模糊；给予高、中、低剂量肠激安胶囊后结构层次恢复清晰可见；给予匹维溴铵后海马组织层次无好转；(3)与空白对照组比较,IBS-D模型大鼠结肠组织和海马组织中5-HT3受体平均光密度值均显著增加(aP<0.05),给予高、中、低剂量肠激安胶囊后,5-HT3受体平均光密度显著下降(bP<0.05),且存在一定的浓度依赖性；给予匹维溴铵后结肠组织中5-HT3受体平均光密度显著下降,但海马组织中5-HT3受体平均光密度反而升高；空白对照组大鼠海马组织和结肠组织中5-HT3受体平均光密度存在高度的相关性(r=0.9047,P=0.000<0.05)；而模型组大鼠海马组织和结肠组织中5-HT3受体平均光密度无明显的相关性(P=0.123>0.05)；给予高、中剂量肠激安胶囊后,IBS-D大鼠海马组织和结肠组织中5-HT3受体平均光密度存在高度的相关性(r=0.8722,P=0.001<0.05；r=0.8140,P=0.004<0.05)；给予低剂量肠激安胶囊和匹维溴铵后,IBS-D大鼠海马组织和结肠组织中5-HT3受体平均光密度无明显的相关性(P=0.183>0.05；P=0.164>0.05)；各组大鼠结肠组织和海马组织中CCK-8的表达无显著差异(P>0.05),且无明显的线性关系。结论：(1)所建立的IBS-D模型大鼠呈现出内分泌失调和电解质紊乱的状态,而疏肝健脾止泻复方中药能通过下调血清中5-HT、DA、ACTH和CORT含量,增加K+、Na+含量,维持机体内环境稳态而达到改善IBS-D症状的目的；(2)5-HT3受体表达量的增加可能是引起IBS-D内脏痛阈值降低、敏感性升高的重要原因之一,疏肝健脾止泻复方中药干预IBS-D的作用机制可能是用过下调模IBS-D模型大鼠海马和结肠组织中5-HT3受体表达水平,减少其与5-HT的结合,减弱神经元的兴奋性,从而提高内脏痛阈值,消除肠道的高敏感性。第四部分：疏肝健脾止泻复方中药对IBS-D大鼠免疫系统的调节机理研究目的：探讨Th1/Th2细胞漂移在IBS-D中的发病机制,疏肝健脾止泻复方中药对Thl细胞因子IFN-yγ、IL-2和Th2细胞因子IL-4、IL-10含量及IFN-y及IL-4 mRNA表达水平的影响。方法：(1)以肝郁脾虚型IBS-D大鼠为研究对象,随机分为肠激安高、中、低剂量组、匹维溴铵组和模型对照组,另取正常大鼠作为空白对照,给予相应药物干预后,取海马组织和结肠组织,处理后采用放射免疫法检测其组织中Th1细胞因子IFN-γ、IL-2和Th2细胞因子IL-4、IL-10含量；(2)提取海马组织和结肠组织中总RNA,并鉴定其浓度和纯度,采用嵌合荧光法RT-PCR扩增后检测其IFN-y及IL-4 mRNA表达水平。结果：与空白对照组比较,模型组大鼠结肠Thl细胞因子IL-2和IFN-γ均显著升高(aP<0.05),而Th2细胞因子IL-4和IL-10均显著降低(aP<0.05),且IFN-γ/IL-4值显著升高(aP<0.05)；给予高、中剂量肠激安胶囊后,Thl细胞因子IL-2和IFN-γ均显著降低(bP<0.05),而Th2细胞因子IL-4和IL-10均显著升高(bP<0.05),且高剂量组IFN-y/IL-4值显著升高(bP<0.05)恢复至接近正常水平(aP>0.05),均显著高于匹维溴铵组(cP<0.05)；与空白对照组比较,模型组大鼠海马组织Thl细胞因子IL-2的含量显著降低(aP<0.05),IFN-γ的含量显著升高(aP<0.05),而Th2细胞因子IL-4、IL-10均显著降低(aP<0.05),且IFN-y/IL-4值显著升高(aP<0.05),给予高、中剂量肠激安胶囊后,Thl细胞因子IL-2含量显著升高(bP<0.05),IFN-y含量显著降低(bP<0.05),而Th2细胞因子IL-4和IL-10均显著升高(bP<0.05),且高剂量组IFN-y/IL-4值显著降低(bP<0.05)恢复至接近正常水平(aP>0.05)；RT-PCR结果显示,IL-4 mRNA在模型组大鼠海马组织和结肠组织中的表达水平均低于空白对照组,IFN-γmRNA在模型组的表达水平均高于空白对照组,给予肠激安胶囊后,能显著降低IFN-γmRNA的表达水平,提高IL-4mRNA的表达水平。结论：Th1/Th2细胞向促炎因子Th1方向漂移可能是IBS-D免疫系统紊乱的重要因素之一,而疏肝健脾止泻复方中药可能是通过降低IFN-γ/IL-4在海马和结肠组织中的含量,下调IFN-γ mRNA的表达,上调IL-4 mRNA的表达,从而使Th1/Th2恢复动态平衡而发挥治疗IBS-D的作用。