疏肝健脾法对IBS-D模型大鼠脑肠轴异常通路调控机制研究

本研究在课题组前期成功制备的IBS-D大鼠模型、肠激安方制剂工艺、肠激安方治疗IBS-D药效学的基础上(广州市科技局课题：肠激安胶囊治疗腹泻型IBS产业化开发,编号：2008A1-E4101-6；肠激安胶囊治疗腹泻型IBS临床前开发,编号：2005J1-C0201),从动物和分子生物学水平,探讨疏肝健脾法调控IBS-D大鼠模型“脑-肠轴”异常的作用机制。 目的： 改进IBS-D大鼠模型,完善该模型的评价方法；探讨以疏肝健脾为治则组成的肠激安方对IBS-D大鼠的淋巴细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+的调控作用；探讨肠激安方给药组和模型组下丘脑和结肠组织蛋白质双向电泳图谱,结合质谱技术鉴定并分析差异表达蛋白,对候选表达差异蛋白进行蛋白质功能研究,进一步阐明疏肝健脾法对IBS-D模型大鼠脑肠轴异常通路调控机制。 方法： (1) IBS-D模型的制备和评价：采用母子分离,束缚,醋酸刺激三因素法制备IBS-D大鼠模型。模型组乳鼠从第2天至第14天每天上午8点到11点将乳鼠和母鼠分离3h,然后与母鼠一起饲养至第22天断奶,第30天分笼。将所有模型大鼠混合均匀,从中随机选取雌性大鼠30只。正常组不分离,于第30天同法操作。于出生后第35天剔除体重小于120g者,随机选择雌性大鼠各20只,模型组每天上午给予番泻叶水煎液按1ml/l00g大鼠灌胃,灌胃结束后立即用纸袋束缚大鼠的前肩、前上肢和胸部,限制其上肢挠抓头面部,但不限制其活动,束缚时间1h。正常组同法给予生理盐水灌胃,不做束缚处理。连续灌胃1周,每天1次。通过大便含水量的测定、内脏高敏感性进行评价,常规病理组织学检查等方法进行模型的评估。 (2)肠激安方对淋巴细胞亚群CD3+、 CD4+、CD8+的含量的影响：肠激安方高、中、低剂量组的大鼠药效学剂量分别为2.812g生药/kg,1.406g生药/kg,0.703g生药/kg。中药饮片按常规方法制备成水煎液,大鼠药效学剂量为16.74g/kg。将各组大鼠给予相应的药物,给药体积为10ml/kg。正常对照组、模型对照组同法给蒸馏水10ml/kg。每天灌胃1次,连续灌2周。末次给药三小时后,大鼠乙醚麻醉后眼球取血1ml置于EDTA抗凝管中,取50ul抗凝血分别加入10ul荧光素标记的单克隆抗体CD3+、CD4+、CD8+避光孵育20min,加入溶血素2ml,再避光孵育10-15分钟,至液体澄清透明,1000rpm离心15min,弃去上清液,加入lml PBS洗液混匀,离心5min,弃去上清液,将样品混悬于0.5ml PBS洗液中,结束后,立即取抗凝血加入荧光素标记的单克隆抗体CD3+、CD4+、CD8+上流式细胞仪进行检测。 (3)差异蛋白的筛选：采用双向凝胶电泳法分离IBS-D模型组和肠激安方中剂量组下丘脑和结肠组织差异蛋白,运用MALDI TOF/TOF串联飞行时间质谱仪进行鉴定,运用Gene Ontology将所鉴定的差异蛋白进行功能分类,分析疏肝健脾法治疗IBS-D病理机制中的蛋白相互作用。 (4)使用Western Bloting法检测肠激安方中剂量组和模型组下丘脑PRDX1蛋白和结肠组织LGALS9蛋白的表达。 结果： (1)给予番泻叶灌胃和束缚前(第35天之前),正常组和模型组大鼠粪便含水量均较接近,无显著性差异(P>0.05)；模型组大鼠灌胃番泻叶并进行束缚后粪便含水量激增,与正常组相比较有显著性统计学差异(P<0.05)；在造模结束后2周内(第42-56天),模型组大鼠粪便含水量之间无显著性差异(P>0.05)。 (2)给予番泻叶灌胃和束缚应激前(第35天之前),模型组大鼠痛阈值与正常组大鼠相比,无显著性差异(P>0.05)；给予番泻叶灌胃和束缚应激后,模型组大鼠与正常组大鼠痛阈值存在显著性统计学差异(P<0.05),模型组大鼠痛阈值降低,提示其存在内脏高敏感性,对外界刺激反应较大；从第56天开始,模型组痛阈值升高,第63天模型组大鼠痛阈值与第42天模型组大鼠痛阈值前后比较有显著性差异(P<0.05) (3)结肠病理检查：正常对照组大鼠结肠切片光镜下结肠粘膜形态完好,上皮细胞排列整齐,纵形肌和环状肌分界清楚,粘膜下无充血、水肿,无炎性细胞浸润。模型对照组大鼠结肠切片光镜下偶见上皮细胞排列不整,粘膜下轻度水肿,局部少量炎性细胞浸润,杯状细胞显著增多,形态结构未见明显器质性改变。 (4)与模型组血清中CD3+相比,匹维溴铵组、肠激安方给药组血清中CD3+无统计学差异,与正常组血清中CD4+相比,模型组CD4+比例明显降低,CD8+比例明显升高,CD4+/CD8+比值也显著降低。与模型组相比,肠激安方CD4+、CD4+/CD8+明显升高,CD8+明显降低。 (5)本研究运用蛋白组学的方法寻找IBS-D模型组和肠激安方中剂量组下丘脑和结肠组织的差异表达蛋白谱,结果发现,在结肠组织中,经过生物质谱鉴定,共得到9种蛋白,分别是：LONP1、 LTA4H、 UAP1、 ALDH2、SET2、 HADHSC、 LGALS9、 KRT19、 RPS12。与模型组比较,有8种蛋白下调：LONP1、 LTA4H、 UAP1、 ALDH2、 SET2、HADHSC、 LGALS9、 KRT19。一种蛋白上调：RPS12。在下丘脑组织中,差异倍数在2.5倍以上的蛋白共有10个,分别是：TPI1、PAFAH1B3、PRDX1、NDUFB10、 AK1、S100B. DSTNL1、 PPIA、 COX6A1、 HBB-B1。与模型组比较,给药组有5种蛋白上调：AK1、 S100B、 DSTNL1、 PPIA、 COX6A1,5种蛋白下调：TPI1、PAFAH1B3、 PRDX1、 NDUFB10、HBB-B1。 (6)在下丘脑组织中,与模型组相比,肠激安方中剂量组大鼠下丘脑组织PRDX1蛋白表达水平显著下降(P<0.01)。在结肠组织中,与模型组相比,肠激安方中剂量组大鼠结肠组织LGALS9蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。 结论： (1)采用母子分离、番泻叶水煎液灌胃结合束缚应激法可成功建立肝郁脾虚泄泻的IBS-D大鼠模型,该模型具有内脏超敏、肠道功能障碍、腹泻、抑郁等多种特征,且该模型肠道组织形态无异常病变,能较好的模拟IBS-D属于慢性功能性肠病特点。 (2)疏肝健脾法对IBS-D模型大鼠脑肠轴异常作用机制可能是与升高血清中CD4+以及CD4+/CD8+的含量、降低血清中CD8+的含量有关。 (3)疏肝健脾法对IBS-D模型大鼠脑肠轴异常通路调控可能与降低IBS-D模型大鼠下丘脑PRDX1蛋白和降低结肠组织LGALS9蛋白的表达有关。