肠激安胶囊对IBS-D模型大鼠“脑肠轴异常”调控作用的分子机制及相关差异蛋白的分析

目的： 探讨肠激安胶囊对腹泻型肠易激综合征(IBS-D)模型大鼠血清中促肾上腺皮质激素(ACTH)和皮质酮(CORT)含量的影响；探讨肠激安胶囊对IBS-D模型大鼠下丘脑和结肠组织NPY mRNA的表达和CGRP mRNA表达的影响；建立IBS-D模型组和对照组结肠组织蛋白质双向电泳图谱,结合质谱技术鉴定并分析差异表达蛋白,对候选表达差异蛋白进行蛋白质功能和相关研究,进一步阐明IBS-D脑肠轴异常机制。 方法： (1)将SD大鼠随机分为正常组,模型组,匹维溴铵组(0.018g/kg),肠激安胶囊高(2.812g/kg)、中(1.406g/kg)、低(0.703g/kg)剂量组,每组8只,模型组以及给药组采用母乳分离+醋酸刺激+四肢束缚法制备IBS-D大鼠模型,各组按20mL/kg灌胃给药,正常组和模型组给予等剂量的生理盐水,连续给药14天,采用ELISA法检测各组大鼠血清中ACTH和CORT的含量。 (2)采用实时荧光定量PCR检测大鼠下丘脑和结肠组织中NPY和CGRP mRNA的表达：取冻存组织,加液氮研磨后按每100mg组织加入1mL Trizol试剂,总RNA的提取按TRIzol试剂说明书进行,用琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性,用紫外分光光度计检测总RNA的纯度和含量。引物序列如下：NPY：上游5'-TTCAGCCACCCGAGAT-3',下游5'-GCTTATGACCCGCACTTA-3'; CGRP:上游5'-ATCCATAACATGACAGCATGG-3',下游5'-CAGTTCTTTAAGCATTGGTTCCA-3';内参18S：上游5'-CGACACTACATCAATC-3',下游5'-ATACAACGACAACAAG-3'.荧光定量PCR总反应体积25μL,反应体系为：12.5μL SYBR Green/Fluorescein qPCR Master Mix,前后引物各1μL,1μL cDNA,9.5μL ddH20。反应条件：94℃5min；94℃30s,55℃40s,72℃50s,共35个循环；最后72℃7min结束反应,运用2-△△Ct法计算各组下丘脑和结肠组织中NPY和CGRP基因的相对表达量。 (3)采用双向凝胶电泳法分离IBS-D模型组和正常对照组结肠差异蛋白,运用MALDI TOF/TOF串联飞行时间质谱仪进行鉴定,运用Gene Ontology和Pathway Studio生物信息学方法将所鉴定的差异蛋白进行功能分类,分析IBS-D病理机制中关键蛋白和涉及到的相关通路。 结果： (1)与正常对照组比较,IBS-D大鼠血清中ACTH含量明显升高(P＜0.01),肠激安胶囊高、中剂量组均显著降低大鼠血清中ACTH含量(P＜0.01)；与正常对照组比较,IBS-D大鼠血清中CORT含量明显升高(P＜0.01),肠激安胶囊高、中剂量组均明显降低大鼠血清中CORT含量(P＜0.05)；肠激安胶囊治疗IBS-D的机制可能与下调HPA轴中ACTH和CORT含量有关。 (2)通过荧光定量PCR研究肠激安胶囊对IBS-D模型大鼠下丘脑和结肠组织中NPY mRNA和CGRP mRNA表达的影响,结果表明,与正常对照组比较,IBS-D模型大鼠下丘脑和结肠组织中NPY mRNA表达明显降低,肠激安胶囊高、中、低剂量均能明显提高IBS-D模型大鼠下丘脑NPY mRNA的表达,肠激安胶囊高、中剂量均能明显提高IBS-D模型大鼠结肠NPY mRNA的表达；与正常对照组比较,IBS-D模型大鼠下丘脑和结肠组织中CGRP mRNA表达明显增加,肠激安胶囊高、中剂量组均能明显降低IBS-D模型大鼠下丘脑和结肠组织CGRP mRNA的表达。 (3)本研究首次运用蛋白组学的方法寻找IBS-D模型组和正常对照组结肠的差异表达蛋白特征谱,结果发现差异倍数在2.5倍以上的差异蛋白有15个：氯离子通道蛋白1(Chloride intracelluLar channel protein1, CLIC1);硫氧还蛋白(Thioredoxin, TRX);热休克蛋白(10kDa heat shock protein, HSP10);细胞角蛋白8(Cytokeratin-8, CK8)前梯度同源蛋白2(anterior gradient homolog2, AGR2);肌动蛋白辅助蛋白类似蛋白(Coactosin-like protein, COTL1);淋巴细胞胞浆蛋白1(lymphocyte cytosolic protein1, LCP1);蛋白质磷酸酶2调节亚基1A(protein phosphatase2, reguLatory subunit A, PPP2R1A);烯醇化酶3(Enolase3);泛醇细胞色素C还原酶核心蛋白I(Ubiquinolcytochrome c reductase core protein I, UQCRC1);泛醌NADH脱氢酶Fe-S蛋白1(NADH dehydrogenase Fe-S protein1, NDUFS1);细胞色素C氧化酶亚基5B(Cytochrome coxidase subunit5B, COX5B);二磷酸3核苷酸酶1(3'(2'),5'-bisphosphate nucleotidase1, BPNT1)。结论： 肠激安胶囊高中剂量组治疗IBS-D的机制可能与下调IBS-D脑肠轴异常的机制中HPA轴ACTH和CORT的含量有关；肠激安胶囊对IBS-D大鼠脑肠轴异常机制有调节作用,其作用机制可能是通过上调下丘脑和结肠组织NPY mRNA表达和下调下丘脑和结肠组织CGRP mRNA表达有关；热休克蛋白、硫氧还蛋白、氯离子通道蛋白等可能是IBS-D脑肠轴异常机制中潜在分子标志物。