人表皮黑素细胞—角质形成细胞共培养及11种化合物对黑素沉着的影响研究

目的建立人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养的体外模型，利用一些已知化合物对B16F10细胞、黑素细胞及黑素细胞与角质形成细胞共培养模型进行比较性研究，在B16F10细胞、黑素细胞及黑素细胞与角质形成细胞共培养模型中对一些中药单体进行有关黑素合成以及黑素转运方面的筛选，对筛选出的优势中药单体进行进一步机制研究及临床效果初探。 方法分别培养鼠黑素瘤细胞系B16F10、人表皮永生化细胞系HaCat、人表皮黑素细胞以及人表皮角质形成细胞；建立人表皮黑素细胞-角质形成细胞共培养的体外模型，分别利用倒置显微镜、共聚焦显微镜以及电镜观察共培养模型以及黑素小体的转运。利用鼠黑素瘤细胞系B16F10、人表皮黑素细胞以及共培养模型对一些化学合成药物(氢醌、熊果甙、8-MOP、RA、NO、维胺酯以及烟酰胺)及一些中药单体(丹皮酚、苦参碱、氧化苦参碱、大黄素)进行黑素合成过程(黑素生成及酪氨酸酶活性)影响的研究。同时利用流式细胞仪在共培养体系中观察这些药物对黑素转运过程的影响。利用RT—PCR以及Western—Blot技术检测丹皮酚对于黑素细胞酪氨酸酶mRNA及蛋白表达的变化，同时探讨了其对共培养细胞PAR—2mRNA表达的影响以及丹皮酚对于SLIGRL引起的黑素转运增加的影响。制成10％丹皮酚霜并观察其在皮肤美白及治疗黄褐斑的临床疗效。 结果 1．成功建立人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养的体外模型。在培养的第3、5、7天在倒置显微镜下观察到黑素细胞与角质形成细胞共同存活并通过树突发生联系，随着共培养时间的延长，细胞间通过树突联系增多，同时利用电镜和共聚焦显微镜观察到黑素小体通过树突由黑素细胞转运到角质形成细胞。 2．氢醌、熊果甙、丹皮酚、苦参碱、氧化苦参碱及维胺酯在B16F10、人表皮黑素细胞以及共培养体系中对于黑素合成及酪氨酸酶活性均呈剂量依赖性抑制。其中氢醌、熊果甙、苦参碱及维胺酯在共培养体系中对于黑素合成及酪氨酸酶活性的抑制作用强于其对于黑素细胞单独培养的黑素合成及酪氨酸酶活性抑制作用；丹皮酚在共培养体系中对于黑素合成及酪氨酸酶活性的抑制作用弱于其对于黑素细胞单独培养的黑素合成及酪氨酸酶活性抑制作用；氧化苦参碱在共培养体系中对于黑素合成及酪氨酸酶活性的抑制作用与其对于黑素细胞单独培养的黑素合成及酪氨酸酶活性抑制作用相同。 3．大黄素对B16F10黑素瘤细胞的黑素合成及酪氨酸酶活性在低浓度(1～2μmol／L)无影响，在5μmol／L以上呈剂量依赖性抑制；对人表皮黑素细胞及共培养模型黑素合成及酪氨酸酶活性呈双向作用，即低浓度(1mol／L)促进而高浓度(5μmol／L以上)抑制；所不同的是大黄素在共培养细胞中低浓度时对于黑素合成及酪氨酸酶活性促进作用强于对于单独黑素细胞中的促进，同时高浓度时对于黑素合成及酪氨酸酶活性的抑制作用弱于在单独黑素细胞对于黑素合成及酪氨酸酶活性的抑制。 4．8-MOP及NO在B16F10、人表皮黑素细胞以及共培养体系中对于黑素合成及酪氨酸酶活性均呈剂量依赖性增强，其在共培养体系中对于黑素合成及酪氨酸酶活性的增强作用弱于其对于黑素细胞单独培养的黑素合成及酪氨酸酶活性增强作用。 5．RA剂量依赖性促进B16F10中黑素合成及酪氨酸酶活性，对于黑素细胞的黑素合成及酪氨酸酶活性无影响，而在共培养体系中对黑素合成及酪氨酸酶活性均呈剂量依赖性抑制。 6．烟酰胺对于B16F10及黑素细胞的黑素合成及酪氨酸酶活性无影响，但是对于共培养体系中黑素合成及酪氨酸酶活性有抑制作用。 7．氢醌、熊果甙、丹皮酚、RA、苦参碱、烟酰胺及维胺酯剂量依赖性抑制共培养体系中黑素小体的转运；8-MOP、NO促进共培养体系中黑素小体的转运；大黄素、氧化苦参碱对于黑素小体的转运无影响。 8．丹皮酚剂量依赖性的抑制黑素细胞酪氨酸酶mRNA及蛋白的表达，剂量依赖性的抑制SLIGRL引起的黑素转运增加，对于共培养细胞中PAR-2mRNA表达无影响。 9．10％丹皮酚在美白及治疗黄褐斑方面显示出良好的效果。 结论 1．黑素细胞与角质形成细胞共培养的模型成功建立，并可以观察到黑素小体的转运过程。 2．本模型是以往模型必要补充，在模拟表皮黑素单位及对黑素合成／转运多环节筛选等方面具有一定优势，可以避免一些待筛物的假阳性筛选结果或漏筛，同时在本模型中还发现了一些已知活性药物影响黑素沉着的新机制，如氢醌、熊果甙、全反式维甲酸等还可抑制黑素的转运，8-MOP、NO可以促进黑素的转运。 3．利用本模型对未知活性的中药单体筛选结果显示丹皮酚具有很好的应用开发前景，大黄素及苦参碱有待进一步研究。 4丹皮酚抑制黑素合成的机制涉及抑制酪氨酸酶活性、抑制黑素细胞酪氨酸酶mRNA表达及抑制抑制黑素细胞酪氨酸酶蛋白的表达，丹皮酚抑制黑素转运的机制可能与其抑制PAR-2活性有关，而与PAR-2mRNA表达无关。 5．外用丹皮酚霜可以有效的达到美白皮肤及治疗黄褐斑的作用。