Sirt1-FOXO1信号通路对肝细胞脂代谢的影响及相关调节机制

研究目的:(1)建立细胞脂肪变性模型,并且了解白藜芦醇是否可以改善细胞内脂质堆积状态;(2)如果可以改善,进一步探索可能的分子机制,白藜芦醇是否可以抑制促脂肪合成的关键因子SREBP1的表达,Sirt1-FOXO1信号通路是否参与了调控过程,为白藜芦醇治疗非酒精性脂肪肝提供分子学依据。 方法:(1)四氮唑蓝比色分析法(MTT法)确定软脂酸钠与白藜芦醇的安全用药范围(2)用软脂酸钠诱导HepG2细胞发生脂肪变性,油红O染色法定性与定量检测细胞内脂质含量是否明显增加,确定建立细胞脂肪变模型。(3)设立对照组(Con)、白藜芦醇组(Res)、高脂组(HF)、高脂+白藜芦醇组(HF+Res)、CR组与CR+白藜芦醇组(CR+Res),检测白藜芦醇与CR是否可以使细胞内脂滴有所减少。(4)如果白藜芦醇可以改善细胞内脂质堆积的状态,那么,用RT-PCR与Western blot检测SREBP1表达的变化,并且用免疫荧光的方法间接评估SREBP1的功能(5)用RT-PCR与Western blot检测Sirt1与FOXO1表达的变化,并且用免疫荧光的方法间接评估FOXO1的功能,分析SREBP1表达变化与Sirt1、FOXO1的表达变化之间,是否存在一定的联系。 结果:(1)MTT检测结果表明,软脂酸钠的浓度>0.4mM时,细胞活力明显下降,我们选择0.05-0.3mM作为药物的安全用药范围;白藜芦醇的浓度>100μM时,细胞活力明显下降,因此,我们选择10-50μM作为药物的安全用药范围(2)油红O染色定性与定量测定的结果表明,0.2mM的软脂酸钠可以引起细胞内脂质明显堆积,这一浓度将作用为建立细胞模型的作用浓度。(3)白藜芦醇可以促进Sirt1的表达,呈剂量依赖效应,40μM的白藜芦醇可以引起Sirt1蛋白的表达明显增强(P<0.05),这一浓度将作为白藜芦醇的作用浓度。(4)脂质定量测定表明,高脂组细胞内脂肪积累显著多于对照组(P<0.05);高脂+白藜芦醇组细胞内脂肪积累显著少于高脂组(P<0.05)。这表明,白藜芦醇可以使脂肪变性细胞内脂滴的量减少。(5)RT-PCR和Western blotting检测结果表明,软脂酸钠可以在mRNA和蛋白两个水平上诱导SREBP1的表达,而白藜芦醇可以在一定程度上抑制软脂酸钠的这一效应;另外,与对照组相比,CR组SREBP1的表达是减少的,这也证实了白藜芦醇可以模仿CR的效应。(6)免疫荧光的结果表明,软脂酸钠可以促进SREBP1从细胞胞浆转移至细胞核内,而白藜芦醇则可以抑制软脂酸钠的这一作用;在CR条件下,SREBP1也是主要位于细胞的胞浆中。(7)PT-PCR和Western blotting检测结果均表明,白藜芦醇模仿CR的效应,增加Sirt1与FOXO1的表达;另外,免疫荧光检测结果表明,白藜芦醇和CR都可以使FOXO1的活性增强,与PT-PCR和Western blotting检测结果一致。 结论:白藜芦醇可以改善细胞内脂质堆积状态,分子机制可能是白藜芦醇通过Sirt1-FOXO1信号通路,抑制SREBP1的表达。我们的研究将白藜芦醇诱导的Sirt1-FOXO1信号通路,与SREBP1介导的脂质从头合成联系在一起,为白藜芦醇治疗NAFLD提供了分子学依据。