东亚特有濒危植物黄山梅的亲缘地理学与群体遗传学研究

中国-日本森林植物区系拥有世界上最丰富的温带成分,其物种多样性形成机制一直是生态与进化领域研究的热点问题。尽管东亚地区在第三纪后期和整个第四纪没有被大面积的山地冰川覆盖,但气候剧烈动荡引起的植被变迁对东亚动植物的分布和遗传结构产生了重要影响。同时,伴随气候变化,海平面的升降导致陆桥的连接与隔离事件对物种的分化及在地区间的迁移产生了重要影响。本文以间断分布于中国东部、日本西南部与韩国南部的濒危植物黄山梅属(Kirengeshoma)作为研究对象,通过叶绿体片段的序列分析、核微卫星标记以及基于RAD标签测序技术的单核苷酸多态性分析方法,检测了黄山梅属植物的遗传多样性与群体遗传结构,分析了种间系统关系及分化模式,并探讨了群体进化与地质历史时期气候、环境变迁的关系。同时,结合种群生态学调查资料,提出了就地和迁地保护的策略。研究结果为更好地揭示东亚植物物种多样性形成机制提供了案例。主要研究结果如下： 1.基于叶绿体DNA片段的种间分化与群体谱系地理结构 通过叶绿体DNA (cpDNA)的6个片段(rbcL、matK、trnL-trnF、trnH-trnK、ndhF和atpB)的联合分析,构建了黄山梅属的最大简约树。结果支持形态学上将该属划分为中国、日本分布的黄山梅Kirengeshoma palmata和韩国分布的韩国黄山梅K. koreana。以多个化石校正点估算的黄山梅属分化时间为4.87个百万年,表明了黄山梅属的种间分化约为上新世晚期,而估算的种内分化时间为上新世中期。 筛选了3对cpDNA的基因间隔区片段(trnL-trnF, psbA-trnH和trnS-trnG),对黄山梅属的8个群体(81个个体)进行序列变异分析,共检测出了17种单倍型。属水平有很高的核苷酸多态性(πT=0.0039)与单倍型多样性(hT=0.795)。NST(0.913)显著大于其相应的GST (0.697),表明了现存的黄山梅属群体存在明显的谱系地理结构。失配分布(Mismatch distribution)分析表明,中国黄山梅群体在0.16个百万年时经历了明显的扩张事件。 2.微卫星多态性与群体遗传结构 采用磁珠富集法开发了12对具有多态性的黄山梅微卫星引物,并进行了群体扫描。结果显示：每个位点的观测等位基因数(NA)的平均值为4.6(2-8)；观测杂合度(Ho)、期望杂合度(HE)和多态性信息含量(PIC)的平均值分别为0.497(0.091-0.909),0.624(0.091-0.879)和0.548(0.083-0.809)。检测到3个位点(Kp48、Kp51和Kp74)明显地偏离哈温平衡。所有位点均未检测到连锁不平衡。 运用12对微卫星标记分析了黄山梅核基因水平的遗传多样性和群体遗传结构,揭示了属水平的遗传多样性较高(HE=0.613)。.群体间的遗传分化高(FsT=0.189)。花粉流与种子流的比值为10,表明了与花粉流相比,群体间的种子流受到极大的限制。2MOD结果分析显示：与中国群体比较,日本的黄山梅群体受到严重的遗传漂变。 3.基于RAD tag方法的单核苷酸群体多态性分析 本研究首次利用RAD tag方法建立了适用于黄山梅单核苷酸群体多态性(SNP)检测的实验流程。基于26个个体的基因组,获得了超过201百万条RADtag序列,平均每个个体的序列为6.4百万条。在最终矩阵中检测到106,293个SNP,平均深度为6.7x。 基于SNPs数据,构建了黄山梅属系统发育树。该系统树的拓扑结构与6个叶绿体片段联合分析的结果一致,支持属下两个形态学种的划分。在中国、日本支系内,进一步支持地区间的基因型互为单系类群。表明了该方法适用于非模式物种的系统进化与亲缘地理学研究。 结合上述分析,我们得到以下的结论：绣球花科黄山梅属下存在两个独立的种(K. palmata vs. K. koreana)。 K. palmata (中国、日本)与K. koreana(韩国)之间的分化时间为上新世早期,种的分化与存在于日本和韩国之间的对马岛海峡开关闭合相关。黄山梅种下地区分化与更新世早期气候的动荡有关。中国天目群体由于季风的原因与中国其他群体(龙塘山、清凉峰与黄山)在更新世中期分化。不同地区黄山梅群体的亲缘地理学研究表明：中国地区的黄山梅群体在更新世晚期经历了扩张事件,而日本地区的黄山梅群体经历了更为严重的遗传漂变。该结果不仅表明第四纪的气候变迁与古老的地质历史与气候事件促进了异域物种形成,影响群体地理分布于遗传结构的主要因素,而且反映了东亚异域物种形成与物种多样性机制。本研究的多个分子标记比较研究表明,基于RAD tag方法检测SNP具有可行性、可靠性与精确性。研究结果为东亚濒危物种黄山梅就地保护与迁地保护工作提供扎实的理论基础。