第一部分牡蛎活性肽的制备和营养成分分析
目的制备牡蛎活性肽及分析活性肽的营养成分。方法牡蛎酶解液经Sephadex G-50柱层析分离,收集牡蛎活性肽,冷冻干燥;采用葡聚糖凝胶层析法测定活性肽的相对分子量分布范围,用HPLC测定牛磺酸含量,用氨基酸分析仪测定氨基酸总量,用蒽醌法测定糖原含量,用双缩脲法测定蛋白含量。
结果用Sephadex G-50层析能达到较好的分离效果;牡蛎活性肽其相对分子量主要集中在5kD以下,牛磺酸含量为3.33%,氨基酸总量为44.30%,糖原含量为26.12%,蛋白含量为27.16%.
结论该方法简便,分离效果好,得到的牡蛎活性肽含有人体所需的各种氨基酸,并含有较高的糖原和蛋白质,可以作为功能性食品进一步深入开发利用。
第二部分牡蛎活性肽降血糖作用研究
目的研究牡蛎活性肽的降糖效果及可能的作用机制。
方法将昆明种健康小鼠220只,雌雄各半,分成正常实验、干预实验和治疗实验。正常实验,设正常对照组(NC)和牡蛎活性肽低、中、高剂量组;干预实验设NC、模型对照组(MC)、牡蛎活性肽低、中、高剂量组;治疗实验,分为NC、MC、阳性药物对照组和牡蛎活性肽低、中、高剂量组。采用腹腔注射四氧嘧啶200mg/kg(按小鼠体重)造糖尿病模型小鼠,NC和MC灌胃生理盐水,牡蛎活性肽低、中、高剂量组按0.5g/kg、1g/kg、2g/kg(按小鼠体重)灌胃,阳性药物二甲双胍按0.5g/kg灌胃。实验结束,小鼠称重,经眼球取血用葡萄糖氧化酶法测空腹血糖,处死后取出胸腺、脾脏、肝脏和肾脏称重并计算脏器指数,通过胰腺做病理切片观察其形态学改变,采用酶法、紫外分光光度法测定甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白、丙二醛、羟自由基、血尿素氮、血清钙等生化指标。
结果正常实验,牡蛎活性肽各组小鼠的血糖、体重、肝脏指数及肾脏指数与正常对照组比较没有明显差异,BPO高剂量组的胸腺指数和脾脏指数较正常对照组有差异。干预实验,模型对照组和BPO各剂量组小鼠的胸腺指数和脾指数降低,BPO高剂量组小鼠的胸腺指数和脾指数与模型对照组相比均有显著性差异(P<0.05),牡蛎活性肽中、高剂量组小鼠的血糖水平均显著性低于模型对照组(P<0.05)。治疗实验,牡蛎活性肽中、高剂量组小鼠血糖显著低于模型对照组(P<0.01),接近药物对照组水平,且与模型对照组相比,各剂量组提高小鼠高密度脂蛋白、血清钙的含量,降低TG、CHO水平;中、高剂量组显著提高小鼠的胸腺指数和脾指数(P<0.05),极显著提高机体清除羟自由基的能力(P<0.01),并极显著降低血清MDA、BUN含量(P<0.01).病理学观察发现,牡蛎活性肽组小鼠的胰岛损害程度较模型组轻,高剂量组小鼠的胰岛有较大程度的改善,二甲双胍组有明显改善。
结论1.牡蛎活性肽对正常小鼠的血糖、体重、器官重量无明显影响。
2.牡蛎活性肽能阻抑四氧嘧啶诱导的小鼠血糖,提示它对四氧嘧啶诱导糖尿病小鼠的形成、胰岛的损伤有一定的保护作用。
3.牡蛎活性肽能降低高血糖小鼠的血糖水平,表明牡蛎活性肽具有促进胰岛组织修复和恢复其分泌的功能。
4.牡蛎活性肽可降低血清MAD、TG、CHO、BUN,并能提高高血糖小鼠的胸腺和脾脏指数,提示牡蛎活性肽具有调节血脂,清除自由基、提高机体抗氧化能力和增强免疫功能的作用。
第三部分牡蛎ACE抑制肽的提取和活性测定研究
目的酶解牡蛎提取ACE抑制肽及活性测定。
方法应用盐析、Sephadex G-100凝胶层析和DEAE Sepharose CL-6B离子交换法从猪肺中分离纯化血管紧张素转化酶(ACE);以新鲜牡蛎为原料,运用酶解法制备牡蛎ACE抑制肽,从牛胰蛋白酶、碱性蛋白酶、动物蛋白水解酶中筛选出最佳的酶解条件,经SephadexG-25分离酶解液;采用RP-HPLC法测定牡蛎ACE抑制肽的抑制活性。
结果分离纯化的ACE酶达到了电泳纯,可用于HPLC的测定;筛选出最佳的酶解条件是:用碱性蛋白酶,pH为9.0,酶解4小时,酶解温度为55℃;分离得到的四个组分(0.48mg/ml),ACE抑制率分别为25.02%、41.78%、60.44%、17.45%。
结论用碱性蛋白酶酶解牡蛎得到的ACE抑制肽活性最强;采用HPLC方法测定ACE抑制肽的抑制活性,具有操作简便、精密度和准确性高的特点。
