促红细胞生成素对同型半胱氨酸导致血管内皮细胞损伤的保护作用及机制研究

实验背景： 脑血管疾病(cerebrovascular,CVD)是各种原因引起的单一或多处脑血管损害而导致暂时性或永久性脑功能障碍的一类疾病。脑血管病是导致人类死亡的三大疾病之一,脑血管病中,以脑卒中发病率较高,在世界范围内平均年发病率为140/10万-200/10万,并且在发达国家的发病率及患病率高于发展中国家,但近年来发现发达国家的脑卒中死亡率呈缓慢下降而发展中国家的脑卒中患病率已经逐渐超过了发达国家,则有所上升。我国目前脑血管病在人口死因中位居第二位,且有逐渐上升的趋势,并且发病有年轻化的趋势。病后有60%-75%的人存在偏瘫、丧失劳动能力等情况,重度致残者占据40%以上。因此对于脑血管病的预防和治疗的研究是当今的热点。 高血压病和动脉粥样硬化(arteriosclerosis AS),是脑血管病最主要和常见的病因。有资料表明,脑出血患者有93%有高血压病史,脑血栓形成患者也有86%有高血压病史,70%的脑血管病患者有动脉粥样硬化病史。现已明确的导致AS的危险因素包括高血压、糖尿病、高脂血症、吸烟、肥胖和家族遗传等,但临床上可见一些患有脑血管疾病的病人未查见上述危险因素。近年来的研究已确认,同型半胱氨酸(Homocysteine,Hcy)是AS新的、独立的危险因素,流行病学调查显示,冠心病及脑血管病患者血浆同型半胱氨酸升高以及血清叶酸、维生素B6、B12水平下降。而在临床研究中发现,予以药物处理减少体内Hcy的浓度后,缺血性脑卒中患者再发脑卒中的可能性有所降低。高同型半胱氨酸尿症患者尸检病理可见动脉内膜粥样硬化斑块形成。实验室在对Hcy的研究中发现,Hcy一般是由于其导致血管内皮细胞的损伤从而导致动脉粥样硬化的形成。Hcy导致血管内皮损伤的可能机制包括：1、分泌炎症因子、参与细胞炎症反应。2、改变内皮细胞基因表达,诱导细胞凋亡。3、产生羟自由基、过氧化氢等氧自由基,导致细胞的氧化损伤。4、一氧化氮合成酶受到抑制,内皮依赖性血管舒张因子(EDRF)产生减少,使内皮依赖性血管扩张作用严重受损。5、内皮细胞表型发生改变,干扰纤溶酶原激活物的结合位点。 促红细胞生成素主要由肾脏皮髓交界处的肾小管旁细胞分泌,主要作用为促红系祖细胞分化及分裂为成熟红细胞,在目前的临床上广泛应用于治疗肾衰竭、化疗级外科手术等多种原因所造成的贫血。但近来的研究表明促红细胞生成素具有潜在的细胞保护作用,国内外有研究证实,EPO对于心肌缺血缺氧损伤、脑缺血损伤、颅脑外伤、脊髓缺血缺氧损伤、肺损伤、急性肾损伤等都具有一定的保护作用。多项研究发现,在心血管系统中,EPO的组织保护作用机制有：减少细胞凋亡、控制炎症、增加内皮氮氧合酶的生成、刺激血管生成、促进内皮祖细胞的增殖和分化,增加抗氧化酶的表达,减少氧自由基的产生。在神经系统中,EPO的组织保护作用机制有：改善脑血流量、刺激血管生成、影响神经传到素的释放、控制炎症及免疫反应、刺激未分化的施旺细胞的增殖、减少细胞的凋亡。 NF-κB是在成熟的B淋巴细胞中发现的一种转录因子,在对其的研究中发现,NF-κB转录调节了许多重要的生理过程,在体内参与多种基因的调节,与炎症反应、免疫反应、应激反应、细胞增殖、细胞转化和细胞凋亡等有关,特别是在细胞凋亡中的作用是现今学者较为关心的话题。静息状态下,NF-κB以失活状态存在于细胞浆中,NF-κB由两类亚基形成同源或异源二聚体,最常见的NF-κB亚基组成形式为p65/p50或p65/p65。在炎症因子、生长因子或趋化因子等刺激因素存在下,NF-κB可以被激活,IκB-α会在Ser32和Ser36被磷酸化,随后被泛素-蛋白酶体途径降解。NF-αB和IκB-α解聚后,其核定位序列被暴露,从而被转运到细胞核内促进NF-κB依赖的基因转录。有文献研究分析指出,Hcy可能通过对NF-κB的活化,诱导并激活细胞黏附分子、趋化因子、炎症因子等基因表达,从而导致血管壁的慢性炎症,促使AS的发生。而在EPO对损伤的心肌细胞缺血缺氧损伤的保护作用的研究中发现,使用EPO预处理后心肌细胞中的NF-κB提前活化,可通过负反馈机制抑制细胞损伤后NF-κB的进一步活化,从而抑制损伤后炎症反应的发生。近年来在对NF-κB在细胞凋亡中的作用的研究中发现NF-κB可以调控凋亡的相关基因,如可以直接上调凋亡抑制因子(c-IAP、c-IAP2和IAXP)、肿瘤坏死因子受体相关因子(TRAF1和TRAF2)、Bcl-2家族、锌值蛋白A20、超氧化锰歧化物等抗凋亡基因的表达,起到抑制细胞凋亡的作用。在对神经损伤的研究中学者发现NF-κB起到了抑制神经细胞细胞凋亡的作用。 实验目的： 本实验旨在观察Hcy是否对血管内皮细胞造成损伤作用,EPO在控制炎症反应以及抑制细胞凋亡等方面对于Hcy诱导的内皮细胞损伤是否具有一定的保护作用,并探讨EPO减少Hcy诱导的内皮细胞凋亡其可能存在的保护机制是否与激活NF-κB通路有关,有可能为脑血管病的二级预防提供一定的借鉴。 实验方法： 第一部分：HUVEC细胞株的培养。采用ATCC购买的人脐静脉内皮细胞株(HUVEC), HUVEC解冻后复苏,培养于含有10%胎牛血清的α-MEM培养基中,置于37℃,5%C02的培养箱中孵育,定期观察细胞形态。待细胞融合至80%左右,用含EDTA的胰酶消化传代后接种于培养瓶或培养板中,待细胞长至60%左右用于下一步实验。 第二部分：观察Hcy对HUVEC的损伤作用。将培养好的脐静脉内皮细胞传代后培养24h,再加入不同浓度(1.25mmol/L、2.5mmol/L、5mmol/L、10mmol/L、20mmol/L)的Hcy处理24h,用MTT法检测细胞存活率。 第三部分：观察EPO对Hcy诱导的HUVEC损伤的保护作用。将培养好的脐静脉内皮细胞传代后培养24h,然后实验分组,空白对照组只加入无血清的培养基,Hcy处理组加入1Ommol/L的Hcy培养基,EPO预处理组先加入不同浓度(0.1U/ml、1U/ml、1OU/ml、100U/ml)的EPO预处理1h,再加入含Hcy(1Ommol/L)的无血清培养基中共孵育24h。采用MTT法检测细胞存活率,ELISA法检测细胞上清IL-6含量,Hoechst33258染色检测观察细胞凋亡并粗略计算细胞凋亡率。 第四部分:NF-KB介导EPO减少Hcy诱导的血管内皮细胞凋亡的机制研究。将上述培养好的内皮细胞作如下分组：(1)正常对照组：在无血清培养基中孵育24h。(2)Hcy处理组：在含Hcy的无血清培养基中孵育24h (Hcy终浓度为10mmol/L)。(3) EPO预处理组：先加入EPO (EPO浓度为100u/mL)预处理1h,再加入含Hcy的无血清培养基中孵育24h (Hcy终浓度为10mmol/L)。(4)EPO组：在含EPO的无血清培养基中孵育24h(EPO浓度为100u/mL)。细胞经分组处理后,MTT法检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,使用细胞核蛋白抽提试剂盒提取细胞核蛋白,Western blot法检测细胞核内NF-κB的表达。 实验结果： 1.人脐静脉内皮细胞株在体外呈贴壁生长,细胞形态为短梭形或多角形,细胞融合生长后呈铺路石样,一般3天可传代一次。 2.与正常对照组相比,HUVEC经Hcy处理后,细胞存活率降低,差异有统计学意义(P<0.01),且呈剂量依赖,随Hcy的浓度增高而降低。 3.与正常对照组相比,经Hcy处理后HUVEC的细胞存活率下降(P<0.01)。而与Hcy损伤组相比,经EPO预处理后,细胞存活率较Hcy损伤组上升(P<0.01),且呈剂量依耐,随EPO的浓度增高而增高。与正常对照组相比,经Hcy处理后细胞上清的IL-6浓度增高(P<0.01)。而与Hcy损伤组相比,经EPO预处理后,细胞上清的IL-6浓度较Hcy损伤组降低(P<0.01),且呈剂量依耐,随EPO的浓度增高而降低。与正常对照组相比,经Hcy处理后HUVEC的凋亡率升高(P<0.01)。而与Hcy损伤组相比,经EPO预处理后,细胞凋亡率较Hcy损伤组降低(P<0.01),且随EPO的浓度增高而降低。在Hoechst33258染色可见正常细胞的细胞核呈均匀淡染的蓝色,而凋亡细胞的细胞核会出现核固缩,染色质浓集和凋亡小体等典型的凋亡特征。 4. Western blot法检测的结果显示,NF-κB在正常对照组的细胞核中基本不表达。与正常对照组相比较,Hcy处理后,细胞核内NF-κB蛋白表达有所增加(P<0.01)；EPO预处理组及单独EPO组细胞核内NF-κB蛋白表达明显增加(P<0.01)；而与Hcy处理组相比,EPO预处理组细胞核内NF-κB蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.01)。 结论： 1.Hcy可导致人脐静脉内皮细胞的损伤。 2.EPO对Hcy导致的人脐静脉内皮细胞的损伤有一定的保护作用。 3.EPO的保护内皮细胞凋亡作用其胞内信号转导机制可能涉及到NF-κB的活化。