龙胆苦苷镇痛与抗抑郁的中枢作用及机制研究

研究背景:临床研究强烈提示痛和抑郁具有高度的共患性,患有其中一种疾病后,罹患另外一种疾病的概率就会增加。慢性痛与抑郁的并发不仅会降低治疗效果,增加治疗难度,而且严重影响患者的生活质量和治疗信心。近年来,慢性痛和抑郁错综复杂的相互作用备受瞩目,被称为“痛-抑郁综合征”或者“痛-抑郁二联征”。目前仅有两个上市药物既被批准用于抑郁症的治疗,同时也有外周神经痛、纤维肌痛的适应症,痛-抑郁综合征的药物治疗机遇与挑战并存,是临床前药物研究亟需解决的问题。NMDA作为中枢神经系统重要的兴奋性受体,在情绪调节和痛觉的传递中发挥重要的作用。动物实验和临床研究表明NMDA受体拮抗剂不但能够缓解纤维肌痛的疼痛症状,而且能够快速、有效的缓解难治性抑郁患者的症状。NMDA受体有望成为痛-抑郁综合征药物治疗的靶点。然而,现有NMDA受体拮抗剂静脉注射的给药途径以及拟精神病的副作用限制了其临床应用,因此亟需针对该靶点寻找安全有效的药物。单胺递质学说是抑郁症发病机理的主流学说,然而基于单胺递质学说的抗抑郁药只能缓解50%的抑郁症状;即便症状被控制,也有60%的患者有复发倾向。事实上,科学家探索抑郁的发病机制,寻找新的药物治疗靶点的脚步从未停止。近年来,抑郁的炎症学说得到了多方面证据的支持。首先,抑郁症患者血浆和脑脊液中IL-6、TNF-α等炎性因子的水平显著升高;其次,炎性因子或者炎性因子的诱导剂可以使人或者动物出现抑郁样症状;再次,减弱炎症反应可以缓解抑郁症状。由此可见,炎症在抑郁的病理过程中发挥着重要的作用,炎症通路也可能成为抑郁症治疗的新靶点。炎性因子激活色氨酸降解途径,导致神经毒性物质及NMDA受体激动剂喹啉酸的蓄积,是炎症导致抑郁的主要病理学机制。由此可见,抗炎与NMDA受体拮抗双靶点的药物有望为抑郁症的药物治疗提供新的策略。目的与意义:本课题研究了龙胆苦苷(gentiopicroside,Gent)对于利血平诱导的痛-抑郁综合征、LPS-诱导的抑郁以及LPS诱导的中枢神经系统炎症的作用及作用机制,评价了Gent的药代动力学特征和血脑屏障的通透性,首次报道了Gent对抑郁与中枢神经系统炎症的潜在治疗作用,填补了Gent中枢药理作用研究的空白,为Gent及龙胆属药物的开发提供了依据,也为探索痛-抑郁综合征和抑郁的药物治疗靶点做了有益的尝试。研究方法:第一部分Gent对利血平诱导的痛-抑郁综合征模型小鼠的作用与机制建立利血平诱导的痛-抑郁综合征小鼠模型,采用热刺激痛和机械痛评价Gent对痛觉敏感性的影响,采用强迫游泳、悬尾实验和旷场实验考察Gent对抑郁样行为的影响;采用HPLC检测基底杏仁核脑组织中单胺类神经递质的变化、试剂盒检测氧化应激水平的变化,Western blot检测谷氨酸受体和凋亡相关蛋白的表达,阐明Gent缓解利血平诱导痛-抑郁综合征的作用机制,并用Glu N2B受体阻断剂进行验证。第二部分Gent对LPS诱导的抑郁症模型小鼠的作用与机制建立LPS诱导的小鼠抑郁模型,采用强迫游泳、悬尾实验和旷场实验考察Gent对抑郁样行为的影响;ELISA试剂盒检测血浆和脑组织中炎性因子的水平;LC-MS/MS检测脑组织中色氨酸及其代谢产物的变化,用犬尿氨酸/色氨酸表示IDO的酶活性;Western blot检测相关蛋白的表达,阐明Gent缓解LPS诱导小鼠抑郁样行为的作用机制。第三部分Gent对LPS诱导的小鼠中枢神经系统炎症的作用与机制建立原代培养星形胶质细胞和原代皮层神经元培养体系;采用MTT、ELISA、Western blot以及免疫荧光考察Gent对LPS诱导的星形胶质细胞激活的影响,以及激活星形胶质细胞对神经元损伤的保护作用;采用在体实验考察Gent对LPS诱导的小鼠中枢神经系统炎症的作用。第四部分Gent在小鼠体内的药动学和血脑屏障的通透性研究建立小鼠血浆、脑组织和脑脊液中Gent含量测定的LC-MS/MS方法并进行方法学验证;采用DAS 2.0软件对小鼠静脉注射Gent后的体内过程进行模拟,计算药代动力学参数;通过比较脑组织和脑脊液中Gent的药物浓度表征其血脑屏障通透性。研究结果:第一部分1.Gent可以缓解利血平诱导痛-抑郁综合征模型小鼠对热刺痛和机械痛的痛敏,改善抑郁样行为,且具有剂量依赖性;2.Gent可以提高利血平诱导痛-抑郁综合征模型小鼠BLA中单胺递质的水平,降低氧化应激,且具有剂量依赖性;3.Gent可以剂量依赖性地下调利血平诱导的BLA脑组织中凋亡相关蛋白和Glu N2B的表达,而对Glu N2A和Glu A1的表达无影响;4.Glu N2B受体特异性拮抗剂Ro25-6981也能够逆转利血平诱导的氧化应激和BLA脑组织凋亡相关蛋白的表达。第二部分1.小鼠腹腔注射LPS造模24 h后病态行为消失,出现抑郁样行为,Gent可以缓解LPS诱导的小鼠抑郁样行为;2.小鼠腹腔注射LPS造模24 h后,血浆中TNF-α和IL-1β与正常组无显著差异;但脑组织中仍有差异,Gent可以降低小鼠BLA和PFC脑组织中TNF-α和IL-1β水平;3.Gent可以下调LPS诱导的脑组织中色氨酸代谢途径的激活;4.Gent可以下调LPS诱导的小鼠PFC脑组织Glu N2B的表达。第三部分1.Gent可以抑制LPS诱导的星形胶质细胞的激活,减少炎性因子的释放,缓解激活星形胶质细胞对神经元的损伤;2.Gent可以通过抑制星形胶质细胞中LPS诱导的MAPK途径和NF-κB途径的激活,下调i NOS和COX-2的表达;3.Gent可以下调LPS诱导的小鼠脑组织中i NOS和COX-2的表达,而且其作用与脑区密切相关。第四部分1.小鼠静脉注射Gent的体内过程符合一室模型,初始血药浓度C0为57.4μg/m L;半衰期t1/2为69.3 min;清除率Cl为0.043 L/min/kg;药-时曲线下面积AUC 0-∞为1995.36 mg/L*min;2.Gent可以通过血脑屏障,在脑组织中代谢消除相对较慢,但无蓄积性。研究结论:1.Gent可以缓解利血平诱导的小鼠痛-抑郁综合征,其作用机制与Gent抗氧化、下调BLA脑组织中Glu N2B的表达密切相关;2.Gent可以通过抗炎和下调Glu N2B表达的双重作用缓解炎症导致的抑郁;3.Gent可以抑制星形胶质细胞中LPS诱导的MAPK途径和NF-κB途径的激活,在中枢神经系统发挥抗炎作用。4.小鼠静脉注射Gent的体内过程符合一室模型,在体内迅速分布,能够通过血脑屏障,在脑组织中较长时间地保持一定浓度,有利于中枢神经系统药理作用的发挥。