白芷提取物对葛根、黄芩、川芎中活性成分生物药剂学性质—膜透过性的影响及机理研究

药物透过肠道的膜通透性质是影响药物口服后经胃肠道吸收的主要因素,中药配伍后可能改变药物活性成分的膜通透性。本文旨在研究葛根中葛根素、黄芩中黄芩苷、川芎中阿魏酸的肠道转运特性、白芷提取物对其转运制性的影响以及影响机理。阐明各成分本身的小肠吸收机理；明确白芷提取物对三种成分肠吸收的作用特点,总结其作用规律；从分子生物角度阐明白芷提取物改变三种成分肠通透性的作用机理。考察白芷提取物的细胞毒性及肠黏膜毒性,评价其用作肠道转运吸收促进剂的可行性,为开发新型辅料一吸收促进剂奠定基础。 目的： 1.研究白芷提取物对葛根中葛根素、黄芩中黄芩苷、川芎中阿魏酸肠道转运的影响,从生物药剂学的角度阐明白芷与它药配伍使用的原理。 2.研究葛根中葛根素、黄芩中黄芩苷、川芎中阿魏酸小肠吸收机制,结合白芷提取物对其肠吸收的影响,探讨白芷对配伍药物中活性成分肠道转运的影响规律。 3.研究白芷提取物对细胞间紧密连接蛋白、外排蛋白(P-gp)、细胞膜流动性等肠道转运屏障的影响,从细胞、蛋白分子等水平上探讨白芷提取物对肠吸收转运阻力的易化作用,从分子机理水平阐明白芷改变配伍药物活性成分膜通透性的作用机理。4.研究白芷提取物的毒性,探索白芷活性成分用作肠道转运吸收促进剂的可行性,为开发新型辅料一吸收促进剂奠定基础。 方法： 1.检索近年来国内外有关“白芷”、“配伍规律”、“葛根”、“黄芩”、“川芎”、“生物药剂学”、“肠道转运”等文献,分析综述中药复方配伍规律、中药配伍对药物肠道转运等生物药剂学性质的影响。 2.建立白芷提取物中欧前胡索、异欧前胡索、总香豆素等含量测定方法；采用大孔树脂分离纯化技术制备白芷提取物;采用水蒸气蒸馏法制备白芷挥发油。 3.外翻肠囊法、Caco-2细胞模型及大鼠在体单向灌流法研究白芷提取物对葛根中葛根素、黄芩中黄芩苷、川芎中阿魏酸肠道转运的变化；分别计算配伍前后葛根中葛根素、黄芩中黄芩苷、川芎中阿魏酸表观渗透系数(Papp),分析白芷两个活性组份对各相配药物中有效成分肠吸收的协同效应。 4.采用Caco-2细胞模型及大鼠在体单向潍流法分别研究稿根中葛根、黄芩中黄岑苷、川芎阿魏酸的肠吸收机制：并分别以肠微粒体、细胞问紧密连接涧节剂(EDTA).外排蛋白抑制剂为工具,探讨各种肠吸收屏障分别在捣根索、黄芩苷、阿魏酸肠道转运过程中的参与度。 5.运用Caco-2细胞模型,采用高效液相、荧光探针标记、蛋白印迹(Western Blot)、流式细胞等技术和手段,分别研究白芷提取物对Caco-2细胞紧密连接蛋白(ZO-1)、细胞坩架蛋白(Actin)、P-gp外排蛋白功能及表达的影响,以及对Caco-2细胞膜流动性的影响。分析白芷活性成分影响葛根中葛根素、黄芩中黄芩讣、川芎中阿魏酸生物药剂学性质的机理。 6.通过病理切片、MTT浊以及Caco-2细胞电阴可逆性测定,研究白芷活性纽分对细胞形态学、组织化学等的影响,探讨白芷活性组分的毒性及其可逆性。 结果 1.通过三种办法左证,得出白芷活性成分能显著健进葛根中葛根素、黄岑中黄岑苷的肠吸收作用(p<0.05),而葛根素和黄芩苷均为难吸收药物,白以活性成分可能对配伍对药中难吸收成分具有吸收作用。全白芷活性成分穿川芎中阿魏酸的肠吸收影响不明显。 2.分别研究了葛根中葛根素、黄芩中黄芩苷、川芎中阿魏酸肠吸收特性,明确了葛根中葛根索、黄芩中黄芩苷及川芎中阿魏酸三个有效成分肠吸收机理。得出(1)葛根中葛根素的吸收机制以被动转运为主,同时存在着主动转运,P-gp和MRP蛋白可能为其主要载体并参与载体转运的过程。(2)黄芩中黄芩苷的吸收机制以被动转运为主,同时存在着主动转运,其转运可能不受P-gp蛋白的影响,MRP蛋白可能为其主要载体并参与载体转运的过程。(3)川芎中阿魏酸的转运过程存在主动载体转运,国入紧密连拨调节剂EDTA后,川芎中阿魏酸肠道转运稍有增加,但作用不显著，印证了其肠道转运以主动转运为主,P-gp和MRP蛋白可能为其主要载体并参与转运的过程,有关期及收机理有待进一步的研究。 分别研究了葛根中葛根索、黄苷中黄芩苷、川芎中阿魏魏酸在肠微粒体中代谢情况,分别筛选了肠微粒体系中葛根中葛根素、黄芩中黄芩苷、川芎中阿魏酸浓度：进一步研究了白芷配伍各约后,葛根素、黄芩苷、阿魏酸在肠微粒体中代谢情况,得出了白芷各活性成分对肠微粒体中各代谢酶无影响的结论。3.采用Caco-2细胞模型,采用蛋白印迹技术开展了白芷活性成分对细胞间紧密连接蛋白ZO-l及骨架蛋白Actin的影响研究；采用流式细胞技术研究了白芷活性成分以P-gp蛋白表达的影响；采用荧光探针标记法研究了白芷活性成分对细胞膜流动性的影响。结果发现白芷活性成分可以抑制细胞间紧密连接蛋白ZO-1和肌动蛋白Aactin的表达；白芷活性成分可以抑制P-gp外排蛋白的功能及蛋白表达：而白芷活性成分对细胞膜流动性影响较小,结果差异无统计学意义(p>0.05),白芷活性成分促进配伍药物中活性成分的肠道转运的机制可能与细胞膜流动性无关。 4.采用LDH、MTT法、电阻可逆性测定、肠黏膜病理切片,综合评价白芷活性成分的毒性及其可逆性。分析判断白芷活性成分作为肠道转运吸收促进剂的可行性。得出白芷活性成分在用量范围内对细胞或肠黏膜组织无毒性的结论。根据此结论,我们认为白芷活性组分具有外发为新型辅料——吸收促进剂的潜能。 结论 采用不同肠吸收模型研究了白芷对配伍药物有效成分吸收的影响,得出了白芷对部分配伍药物中有效成分具有一定的吸收促进作用,初步了解了白芷对配伍药物中活性成分生物药剂学性质的影响规律,有助于我们从生物药剂学角度阐明白芷药物配伍的原理。明确了各配伍药物中有效成分的肠吸收机制以及白芷提取物对各肠吸收屏障的作用机制,结合白芷活性成分的毒性评价,从更深的层面上阐明了白芷-葛根、白芷-黄芩、川芎-川芎药物配伍原理。本课题可为中药配伍理论研究提供新思路；为在中医药理论指导下寻找吸收促进剂提供新思路。本课题的研究结果也将为白芷活性成分开发成新型辅料—吸收促进剂奠定基础;为白芷配伍组方,提高原方疗效提供理论依据。