载铜硅酸盐纳米微粒对断奶仔猪肠道病原菌吸附、杀菌机理的研究

抗生素和高铜被广泛用作动物促生长添加剂。但长期使用此类添加剂存在细菌耐药性、抗生素残留和环境污染等种种弊端。因此，本课题旨在以层状硅酸盐（LSN）为载体，通过阳离子交换反应，并结合纳米技术，构建出载铜硅酸盐纳米微粒（CSN）。将LSN和CSN作为试验材料，以断奶仔猪肠道细菌作为测试对象，采用Caco-2细胞培养试验、体外吸附和杀菌试验以及饲养试验等方法，分析和研究了其作为一种替代抗生素饲料添加剂的可行性和可能性。 采用Caco-2细胞模型，体外首先研究了仔猪肠道四种细菌大肠杆菌K88(E.coli K88)、猪霍乱沙门氏菌（S.choleraesuis）、嗜酸乳杆菌（L.acidophilus）和两歧双歧杆菌（B.bifidum）粘附细胞的基本特点及影响因素；进而研究了加入不同浓度的LSN和CSN对Caco-2细胞的影响、对这四种细菌粘附和入侵肠上皮细胞的影响以及对肠粘膜形态的影响。 体外还将LSN及CSN对四种细菌的吸附和杀菌能力进行了研究。吸附试验中，首先对材料进行了表征，进而研究了在不同时间、不同粒径、不同pH、不同离子强度、不同温度和不同矿物／细菌质量比的条件下，对四种细菌吸附性能的影响并进行机理探讨。 杀菌试验中，采用最小抑菌浓度法（MIC）、“halo”试验法及改良的振荡瓶法在不同时间、不同浓度、不同粒径及不同温度下的CSN对四种细菌的体外杀菌效果做了定性和定量研究，并通过对细菌细胞壁、K+外流、细菌胞内酶、细菌呼吸代谢、有无光照以及铜离子释放量的影响探讨其杀菌机理。 饲养试验中，以28±2日龄断奶“杜长大”三元杂交仔猪为试验对象，研究了添加0.2％和0.3％CSN、250mg／kg硫酸铜及100mg／kg金霉素对断奶仔猪生长性能、腹泻率、肠道微生物菌群、十二指肠及胰脏消化酶、空肠粘膜二糖酶活性以及小肠粘膜形态结构几方面的影响，并对其作用机理初步进行探讨。选择160头健康“杜长大”三元杂交仔猪（初重7.5±0.3kg）按试验要求分为5组（含一个基础日粮组），每组4个重复，每个重复8头（公母各半）。预饲期7天，正式期45天。饲养试验结束后，每组各选体重相近的猪8头（公母各半），共40头，按常规方法屠宰，取相关内容物、血清和组织样品进行肠道微生物菌群、消化酶和粘膜二糖酶活性、小肠粘膜形态结构以及铜、铁、锌含量的测定。主要研究结果如下： 1．细胞培养试验表明，病原菌E.coli K88、S.choleraesuis对细胞的粘附能力分别为12.2％，11.7％；有益菌L.acidophilus和B.bifidum对细胞的粘附能力分别为15.6％和17.7％，可见病原菌对细胞的粘附能力明显低于有益菌（P＜0.05）。当E.coli K88和S.choleraesuis粘附细胞时，可使细胞存活率降低，增殖受阻（P＜0.01）。而L.acidophilus和B.bifidum粘附细胞时，细胞存活率不受影响，使细胞增殖率明 显提高(P（0.01）。 2.通过细胞毒性试验研究结果表明，LSN为1创L，CSN为0.029/L时的浓度 是细胞的生长的最适浓度。也暗示了纳米微粒与细胞具有生物相溶性。 3.E.。oliKS召和5. choleraesuis粘附caco一2细胞后，检测到LDH从细胞内大 量释放出来，ALP含量明显降低。而L.aci‘l(，hilus和B.b沪dum粘附细胞后，细 胞LDH与对照组相比，差异不显著（P>0.05），ALP含量明显升高。 4.用1叭LSN和0.oZg/L CsN处理过的Caeo一2细胞，对E. eolxK88和S. choleraesuis的粘附数量明显增加（p<0.05）;对L.aei和户hilus和B.b沪dum的粘附 能力明显下降（P<0 .01）。两种纳米微粒均可明显抑制四种细菌侵入到Caco一2细胞 中的数量（P<0.01）。提示LSN和CSN可作为消化道粘膜保护剂。 5.丑。oliK砧和S.。holeraesuis与Caeo一2细胞作用后，再加入LSN和CSN可 阻止3h内细菌粘附细胞所导致的LDH的释放，但随细菌粘附时间延长，LSN和 CSN不能阻止LDH的释放。提示LSN和CSN对受损伤的细胞具有一定的修复作 用。 6.体外细菌吸附试验表明，LSN对细菌吸附达平衡所用的时间是60min，CSN 是120min。随粒径的减小、矿物/细菌质量比的增加、离子强度的降低，吸附率明 显增大。当pH二5.8时，细菌吸附到CSN上的吸附率最低。而随着pH增大，细菌 吸附到LSN上的吸附率逐渐减小。在扫描电子显微镜和原子力显微镜图片也明显 可见E. coliKss和s.eholeraesuis吸附在LsN及CSN周围;而L.aei“ophilus和B. b沪dum很少吸附在CSN的周围。两种纳米材料对病原菌的吸附能力显著高于两种 有益菌（P<0.01）。而且改性后的CSN对病原菌的吸附能力显著高于LSN（P<0.01）; 对有益菌的吸附能力明显小于LSN（P<0.01）。 7.通过对两种纳米材料和四种细菌毛电势的测定表明，它们随溶液pH和离 子强度的变化而改变。随pH的升高，csN的毛电势随之升高，并由负值转为正值， 等电点为5.8。其余的毛电势均随pH的升高而降低。随溶液离子强度的增加，毛 电势均增大。CSN的毛电势显著高于LSN。有益菌的弓电势显著高于病原菌 （P<0.01）。本研究也表明，有益菌的疏水性显著高于病原菌（P<O.OI）。吸附机理 可用毛电势、疏水作用力和表面络合模式共同来解释细菌与纳米微粒之间的吸附 作用。 8.体外杀菌试验表明，LSN本身不具有杀菌、抑菌功能;但将具有杀菌、抑 菌功能的金属C