独活寄生汤对小鼠软骨细胞Zinc-ZIP8-MTF1轴的调控作用研究

目的:通过独活寄生汤含药血清对小鼠软骨细胞Zinc-ZIP8-MTF1轴的调控作用研究,探寻独活寄生汤治疗膝骨关节炎（Knee Osteoarthritis,KOA）的作用靶点及作用规律,揭示其治疗机制。为临床独活寄生汤治疗膝骨关节炎（Knee Osteoarthritis,KOA）提供可靠的实验依据。方法:将20只SD大鼠随机分为2组:空白对照组、实验组,每组10只。独活寄生汤按临床等效剂量的10倍灌胃给药,空白对照组给予生理盐水,按1mL/100g体重灌胃。每天上午、下午各1次,连续3天,末次给药1小时后,腹主动脉取血,离心分离血清,56℃水浴30min灭活,分装,-80℃冻存,独活寄生汤含药血清备用,采用表达Zip8的腺病毒感染Ad-Zip8（Vector Biolabs）感染小鼠软骨细胞,感染复数为800MOI,感染时间为2小时,继续培养24小时构建Zip8过表达细胞模型用于实验。排除中药多靶点效应的干扰,采用siRNA靶向沉默Zip8的表达构建Zip8-siRNA基因沉默细胞模型用于实验。将细胞随机分为:空白对照组（Control）、模型对照组（Model/ZnCl2）、Ad-Zip8组（Ad-Zip8）、Zip8-siRNA组（Zip8-siRNA）、低剂量组（2.5%DHJST）?中剂量组（5%DHJST）?高剂量组（10%DHJST）,每组设3个复孔,分组后,培养体系内加入1ng/mL IL-1β;培养24小时后,加入100uM ZnCl2,同时给予含药血清干预;分别采用10%、5%、2.5%（v/v）的含药血清作为高、中、低剂量组（含药血清不足10%的剂量组,给予相应体积正常大鼠血清补足10%）;10%正常大鼠血清作为对照组。继续培养48小时后采用荧光染色技术检测软骨细胞内Zn2+浓度,提取细胞总RNA,去除gDNA,合成cDNA,采用qRT-PCR检测软骨细胞ZIP8,ZNT9,MTF1,Mt1,Mt2基因的表达,采用蛋白质免疫印迹法（Western Blot）结合图像分析ZIP8,ZNT9,MTF1,Mt1,Mt2蛋白表达。结果:1.软骨细胞在IL-1β诱导的炎症状态下,细胞内Zn2+浓度明显增加,加入独活寄生汤含药血清（DHJST）后对Zn2+浓度有一定的影响,由图中染色显像可见含药血清低剂量组Zn2+浓度降低,染色部分减少,5%的含药血清中剂量组Zn2+浓度次之,10%的的含药血清高剂量组Zn2+浓度最低,由此可见独活寄生汤含药血清（DHJST）浓度越高,Zn2+的浓度越低,染色显像部分越少,颜色越淡,独活寄生汤含药血清（DHJST）对Ad-Zip8过表达细胞模型内的Zn2+浓度有一定降低作用。独活寄生汤含药血清（DHJST）对Zip8-siRNA基因沉默细胞模型内的Zn2+浓度有一定降低作用。综上所述,独活寄生汤含药血清（DHJST）对细胞内Zn2+浓度有一定的抑制作用,独活寄生汤含药血清（DHJST）含量越高,细胞内Zn2+浓度越低,反之,细胞内Zn2+浓度越高,故独活寄生汤含药血清（DHJST）可降低炎性状态的软骨细胞内Zn2+浓度。2.根据RT-qPCR检测结果显示,独活寄生汤含药血清对Zip8 mRNA表达水平具有明显抑制作用,但其作用强度不及Zip8-siRNA。同时也发现,独活寄生汤含药血清无法对抗Ad-Zip8引发的Zip8 mRNA过表达,独活寄生汤含药血清对高锌状态下软骨细胞Znt9 mRNA表达水平没有显著性影响,但发现Ad-Zip8导致的Zip8 mRNA过表达可引起Znt9 mRNA表达水平升高,该现象可能与Zn2+大量涌入导致ZNT9负反馈升高有关,独活寄生汤含药血清可下调Mtf1 mRNA表达水平,但其作用强度不及Mtf1-siRNA。独活寄生汤含药血清可有效对抗Ad-Zip8引发的Mtf1 mRNA表达水平升高,独活寄生汤含药血清可明显升高Mt1 mRNA表达水平,且其对Mt1 mRNA表达水平的上调作用不受Zip8mRNA表达水平的影响。3.根据Western blotting检测结果显示,独活寄生汤含药血清对可降低ZIP8蛋白的表达水平,但其作用强度不及Zip8-siRNA。独活寄生汤含药血清无法抑制由Ad-Zip8引发的ZIP8蛋白表达水平升高,独活寄生汤含药血清对高锌状态下软骨细胞的ZNT9蛋白表达水平没有显著性影响,Ad-Zip8可导致ZNT9蛋白的表达水平反馈性升高独活寄生汤含药血清对MTF1的蛋白表达水平无明显影响,该结果与qPCR结果不一致。独活寄生汤含药血清可有效降低Ad-Zip8引发的MTF1蛋白表达水平,独活寄生汤含药血清可明显升高MT蛋白的表达水平,且其对MT蛋白表达水平的上调作用不受Zip8过表达的影响。结论:1.独活寄生汤含药血清（DHJST）可对炎性状态的细胞内Zn2+的浓度具有降低作用,且血清含药量越高,对Zn2+浓度的降低作用越强。2.独活寄生汤含药血清对可降低ZIP8蛋白的表达水平,主要是对Zip8-mRNA表达水平具有明显抑制作用,但无法对抗Ad-Zip8引发的Zip8 mRNA过表达;独活寄生汤含药血清对高锌状态下软骨细胞Znt9 mRNA表达水平没有显著性影响,但发现Ad-Zip8导致的Zip8mRNA过表达可引起Znt9 mRNA表达水平升高,该现象可能与Zn2+大量涌入导致ZNT9负反馈升高有关。3.独活寄生汤含药血清对MTF1的蛋白表达水平无明显影响,但独活寄生汤含药血清可有效降低Ad-Zip8引发的MTF1蛋白表达水平,还可明显升高MT蛋白的表达水平,且其对MT蛋白表达水平的上调作用不受Zip8过表达的影响。4.独活寄生汤可以通过降低Zn2+的浓度,降低Zn2+转运蛋白尤其是ZIP8蛋白水平,减少MTF1被激活量,减少对软骨细胞中MMP家族和ADAMTS家族的表达,这对探寻独活寄生汤治疗KOA的作用靶点和作用规律,揭示其作用机制具有重要意义。