枯草芽孢杆菌氨肽酶的研究

氨肽酶可从氨端切除苦味肽上的疏水氨基酸,从而达到脱苦的目的。本论文从传统食品豆腐乳中筛选到了一株产氨肽酶的菌种,通过16S rDNA遗传学鉴定、形态、培养及生理生化特征的初步研究,鉴定其为食品安全级的枯草芽孢杆菌。单因素法优化了其培养基成分及培养条件,采用四因素三水平的正交实验对可溶性淀粉浓度、氮源浓度、磷源浓度及pH进一步优化。优化后的发酵条件:最适温度30oC,最适转速200r/min,培养时间15h,最适pH值7.2,最佳接种量5%,最佳装液量25mL/250mL,种子液培养时间6h。合成培养基组成（g/L）:可溶性淀粉15,蛋白胨10,牛肉膏2,酪蛋白5,K2HPO4·12H2O为0.16,K2HPO4 2.68,NaCl 1,MgSO4·7H2O 0.1。优化后酶活为766.0U/mL,比出发菌的167.2U/mL提高了4.58倍。 粗酶液经乙醇分级沉淀（37.5%～60%）、SephadexG-75凝胶过滤、Phenyl-sepharose6FF疏水色谱三步得到纯化,比活1.5567×10～6U/mg,回收率12.6%,纯化倍数为100.7 ,SDS-PAGE鉴定为纯酶,分子量约为75KDa,全酶含两个亚基。纯酶最适反应温度为60℃,温度稳定范围在20～70℃。最适pH为8.5, pH稳定范围在8.0～10.0左右。甘油、蛋白胨对酶活有一定的保护作用, Zn2+、Ni2+有较大的抑制作用,而Co2+则对酶活有较强的激活作用。蛋白酶抑制剂PMSF和DFP对氨肽酶无抑制作用, Pepstatin稍有抑制,EDTA强烈抑制酶活性,Co2+可解除EDTA的抑制。枯草芽孢杆菌Zj016氨肽酶活性中心可能结合了两个Zn2+,每个亚基一个。米氏常数Km为1.02μmol/L,最大反应速度Vmax为5675μmol/L/min。 1%的大豆蛋白和酪蛋白溶液经胰蛋白酶水解（E/S:1/100）,水解液呈现苦味,添加E/S为10000U/g的氨肽酶可较好地脱苦,水解液中游离氨基酸的总量增加了26%左右,疏水氨基酸的量也有明显增加。