微粒皮结合人工真皮构建组织工程皮肤修复创面的初步研究

目的：研究微粒皮结合人工真皮支架构建的组织工程皮肤对大鼠背部创面的修复效果。 材料与方法：取SD大鼠随机分为4组制备大鼠背部创面模型。使用微粒皮结合人工真皮支架构建的组织工程皮肤修复大鼠背部创面(D组),分别于术后第一、三、五周观察创面生长情况,并与空白对照组(A组)、人工真皮移植组(B组)、自体原位微粒皮移植组(C组)比较各组创面愈合质量。通过如下指标评价研究此种组织工程皮肤对创面的修复效果。 1.通过大体标本的肉眼观察、对创面收缩率、愈合率的测算及HE染色情况分析对创面修复给出大体评价。 2.表皮修复情况：通过扫描电镜(SEM)对表皮全层厚度的观察评价表皮层修复质量。并在表皮修复中,通过CK15、CD29免疫组化的结果观察皮肤干细胞的分布,探索皮肤干细胞在创面修复中的作用。 3.真皮修复情况：通过Masson染色观察创面真皮层胶原纤维的密度、质地及结构；通过扫描电镜(SEM)对真皮全层厚度的观察综合评价真皮层修复质量。并在此基础上进一步行RT-PCR测定真皮中Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达。 结果：四组大鼠背部创面的修复过程中,使用微粒皮结合人工真皮支架构建的组织工程皮肤对大鼠背部创面具有最佳修复效果,大体观察5周时已达到临床愈合。各组创面在术后第一周时,收缩都十分有限,并未显示出差别；术后第三周各组创面均有了较大幅度的收缩,A组表现尤为突出,B、C组次之,D组最轻收缩率仅为29.0±2.4%；术后第五周各组创面继续收缩,A组的收缩趋于平稳,其他三组创面收缩率均较A组轻,三组之间收缩率的差异无统计学意义(P>0.05)。术后第一周时,A、B组愈合率明显较小,D组愈合较好,C组最佳；术后第三周时B组覆盖面积最小,仅53.8±5.5%,其余各组创面进行性愈合,愈合率均超过70%；术后第五周时各组创面愈合率均超过80%,差异无统计学意义(P>0.05)。术后第五周SEM观察B、C、D三组之间的表皮全层厚度无差别,各组数据差异未见明显统计学意义(P＞0.05),但A组表皮全层厚度小于其他三组(P<0.01)。创面CK15、CD29免疫组化的结果在一定程度上具有一致性,显示表皮干细胞较为集中地分布在创面表皮全层、基底膜、毛囊附近及新生腺体结构,在创面全层的结构中也有散在的分布,且CK15、CD29免疫组化PU值的水平变化反映来自于微粒皮的表皮干细胞在参与创面修复的过程中有所消耗。 HE染色观察创面经过炎性细胞浸润和血管增生后有所退缩,可见表皮下毛囊向表皮聚集,并参与表皮修复,支架材料已基本被自身胶原取代。Masson染色低倍镜下观察术后第一、三、五周四组创面厚度,B、D两组均不同程度高于A、C两组。创面修复过程中真皮层胶原纤维重构,排列趋于整齐。术后第五周时,A组创面胶原密度仍最小,排列较松散；B、D两组人工真皮结构基本已被自体新生胶原所替代,并且D组中渐与微粒皮中的胶原成分融为一体。C、D两组创面中成纤维细胞较A、B两组更为密集。术后第五周SEM观察含有人工真皮修复的B、D两组真皮全层厚度明显大于未使用的A、C两组：其中D组真皮全层厚度最大为768.2±24.22μm,接下来依次为B组、A组,C组真皮全层厚度最小。对D组真皮细微结构的观察显示其真皮层兼具微粒皮和人工真皮两组的修复特点,真皮层上层为排列紊乱的粗大波形的胶原,胶原间的空隙较大,下层胶原束平行排列,致密有序,胶原纤维之间空隙较小两层之间有过渡,形成较为成熟的层次和结构。RT-PCR检测C、D两组Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达水平,两组创面Ⅰ型胶原的表达水平总体较高,且D组Ⅰ型胶原的条带宽度亮度在各时间点均超过C组,尤以术后第一周更为明显；Ⅲ型胶原的表达水平在两组中较为相似,术后第一周Ⅲ型胶原的表达水平明显高于之后两个时间点。结论：微粒皮结合人工真皮支架构建的组织工程皮肤制备方法简单,能成功地运用于修复大鼠背部创面,并显著提高创面愈合质量。