研究目的:本研究通过建立哮喘大鼠激素干预模型,运用临床确有疗效的加减乌梅丸颗粒作为治疗药物,评估该药物对模型大鼠TGF-β1/Smad信号通路的影响以及对气道重塑的阻抑作用,阐明加减乌梅丸颗粒阻抑哮喘大鼠激素干预模型气道重塑的作用靶点及作用机制。研究方法:将健康雄性SD大鼠随机分为正常组、哮喘组、地塞米松组、普米克令舒组及中药组,适应性喂养1周,除正常组外,其余各组均于实验第1天和第8天腹腔注射卵蛋白(OVA)与氢氧化铝佐剂混合液致敏,第15天开始以1%OVA隔天雾化激发,除正常组和哮喘组外,其余各组均在雾化激发前给予地塞米松磷酸钠注射液0.5 mg/kg腹腔注射,按每周0.1 mg/kg速度撤减地塞米松的剂量,普米克令舒组予普米克令舒0.413 mg/kg每日雾化吸入,中药组予加减乌梅丸颗粒1.86 g/kg每日灌胃,均用药7周,观察大鼠一般表征,末次给药24 h后取材。(1)比较各组大鼠肺通气功能及气道重塑程度:大鼠麻醉后检测各组肺通气功能,记录用力肺活量(FVC)、0.2秒用力呼气容积(FEV0.2)、0.2秒内的平均流速(FEV0.2/FVC%)、用力最大呼气流速(PEF)、用力中期呼气流速(FEF25-75%)等数据;处死大鼠后取部分左肺组织固定、石蜡包埋切片,行HE和Masson染色观察各组大鼠肺组织的病理形态学改变,用医学图像分析软件测定气道壁面积(Wat)、气道平滑肌面积(Wam)及两者占气道总面积的百分比。(2)比较各组Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白以及TGF-β1/Smad信号通路各指标变化:对大鼠右肺进行肺泡灌洗,ELISA法检测各组灌洗液中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad6、Smad7含量;取大鼠部分左肺组织,以免疫组化法测定TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad6、Smad7、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的平均光密度值;取大鼠右肺上叶、中叶,分别行Western Blotting和RT-qPCR检测,比较各组大鼠肺组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Smad6、Smad7、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白及mRNA相对表达水平。研究结果:(1)与正常组比较,哮喘组大鼠经卵蛋白激发后可观察到呼吸急促、搔抓口鼻、烦躁不安、腹肌抽搐、时有喷嚏等表现,并逐渐俯伏在一处,反应迟钝,可闻及明显的喘鸣音,地塞米松组同样具有以上表现,但体重明显减轻,毛发色泽更显暗淡,烦躁不安、暴躁程度更为明显,并具有较强攻击性,中药组以上症状均有所改善,喘鸣音减轻;哮喘组肺通气功能指标FVC、FEV0.2、FEV0.2/FVC%、PEF、FEF25-75%均较正常组显著下降(P<0.05),出现了持续性的气流阻塞,地塞米松组相比哮喘组无明显差异(P>0.05),中药组各项指标较二组均有明显改善(P<0.05),气流阻塞症状有所缓解;HE染色及Masson染色结果显示哮喘组气道周围可见大量炎症细胞浸润,气道管腔明显变窄,气道壁、平滑肌层和基底膜层厚度显著增加,间质纤维增生,胶原蛋白沉积增多,Wat%、Wam%较正常组均显著升高(P<0.05),气道重塑明显,地塞米松组相比哮喘组气道改变有所减轻、Wat%显著降低(P<0.05),中药组气道改变较二组均有减轻,气道周围少量炎症细胞浸润,气道壁、平滑肌层和基底膜层厚度降低,胶原蛋白沉积减少,Wat%显著降低(P<0.05);(2)与正常组比较,哮喘组大鼠肺泡灌洗液中TGF-β1、Smad2、Smad3含量均显著升高(P<0.05),Smad6、Smad7含量均显著降低(P<0.05),肺组织中 TGF-β1、Smad2、Smad3、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白及 mRNA 相对表达水平均显著升高(P<0.05),Smad6、Smad7蛋白及mRNA相对表达水平均显著降低(P<0.05);与哮喘组比较,地塞米松组大鼠肺泡灌洗液中TGF-β1含量显著降低(P<0.05),肺组织中 TGF-β1、Smad2、Smad3、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白及 mRNA 相对表达水平均显著降低(P<0.05),Smad6、Smad7蛋白及mRNA相对表达水平均显著升高(P<0.05);与地塞米松组比较,中药组肺泡灌洗液中TGF-β1、Smad2、Smad3含量均显著降低(P<0.05),Smad6、Smad7含量均显著升高(P<0.05),肺组织中TGF-β1、Smad2、Smad3、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白及mRNA相对表达水平均显著降低(P<0.05),Smad6、Smad7蛋白及mRNA相对表达水平均显著升高(P<0.05)。研究结论:加减乌梅丸颗粒通过调控TGF-β1/Smad信号通路,可恢复Smad2/3和Smad6/7的平衡,抑制TGF-β1信号在细胞内的转导,进而减少气道平滑肌增生以及Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ蛋白沉积,抑制气道壁增厚,延缓气道重塑的发展,改善肺通气功能。
