5-羟基多甲氧基黄酮抗结肠癌活性及其分子机制研究

结肠癌是致死率最高的癌症之一。随着西方的饮食习惯和生活方式越来越趋于国际化，结肠癌的发生率也在全球范围内呈上升趋势。我们致力于寻找新颖的膳食功能因子来预防和抑制结肠癌的发生和发展。多甲氧基黄酮是一类结构独特的黄酮类化合物，主要存在于橘属类果实的皮中（陈皮）。目前我们在陈皮中分离得到了一类新颖的多甲氧基黄酮类化合物，也就是5-羟基多甲氧基黄酮。其新颖的结构特点赋予其更加强大的抗肿瘤活性。越来越多的研究表明，特定的具有预防或抑制肿瘤生长的药物之间在低剂量下联合使用可产生协同效应，这不仅能增强抑制肿瘤的活性而且能降低由于高剂量而引发的毒副作用。阿托伐他汀是是目前临床最常用的降胆固醇的药物，它通过抑制肝脏内HMG-CoA还原酶的活性来降低血浆中胆固醇和脂蛋白水平。最新的报道显示阿托伐他汀对多种癌细胞具有潜在的抑制活性，尤其是结肠癌细胞。利用先进的细胞培养和动物模型，本课题对三种最主要的5羟基多甲氧基黄酮抗结肠癌活性及其分子机制进行了系统而深入的研究，并在此基础上开创性地研究了一个全新的抗癌策略：利用5羟基多甲氧基黄酮与阿托伐他汀联合使用而对结肠癌细胞产生强大的协同抑制效应。具体实验结果如下： 1．5-羟基多甲氧基黄酮对结肠癌细胞的显著抑制作用 在此研究中，我们检测了三个主要的5-羟基多甲氧基黄酮，5羟基6，7，8，3’，4-五甲氧基黄酮（5HPMF），5羟基3，6，7，8，3’，4。六甲氧基黄酮（5HHMF），和5羟基6，7，8，4’四甲氧基黄酮（5HTMF）抑制两种人类结肠癌细胞（HCTll6和HT29细胞）增殖的效应，同时，我们也系统的比了三个主要5羟基多甲氧基黄酮与其母体多甲氧基黄酮(分别是：川陈皮素（PMF）、3，5，6，7，8，3’，4-七甲氧基黄酮（HMF）及橘红素（TMF）)抗结肠癌细胞生长的作用。结果显示，与母体全甲氧基化的多甲氧基黄酮相比，5羟基多甲氧基黄酮具有更强的抑制结肠癌细胞生长的作用，这表明5位的羟基基团在增强5羟基多甲氧基黄酮抗肿瘤活性方面起到了重要作用。流式细胞仪的分析结果显示，三个5羟基多甲氧基黄酮能分别对肿瘤细胞周期和细胞凋亡产生不同的效应，这表明三个5羟基多甲氧基黄酮分别通过不同的作用机制来抑制结肠癌细胞的生长。例如，5HPMF可引起HT29细胞G2/M细胞周期滞留，而5HHMF诱导显著的GO/Gl细胞周期滞留；相反，5HTMF可增加sub GO/Gl期细胞数目。为了进-步确认三个5羟基多甲氧基黄酮抑制结肠癌细胞生长的作用机制，我们对细胞总蛋白进行了蛋白质印迹分析，结果表明5羟基多甲氧基黄酮对结肠癌细胞的抑制作用主要基于它们强效调控细胞增殖和细胞凋亡相关重要蛋白的能力(例如，p2lCipl/Wafl，cDK 2，cDK 4，phosphor Rb，Mcl-1，caspases 3＆8，和PARP等蛋白) 2．5-羟基多甲氧基黄酮以p53，Bax和p21依赖方式抑制结肠癌细胞生长 利用人类结肠癌HCTll6细胞的多种等基因变种细胞（例如：p53+/+，p53/，Bax+/-，Bax-/-，p2l-/-细胞），我们进-步研究了重要肿瘤调控蛋白p53，Bax和p2l在三个主要5羟基多甲氧基黄酮诱导的肿瘤细胞周期滞留和细胞凋亡中的作用与影响。Annexin V，PI双染实验结果表明，5HHMF和5HTMF能显著地诱导HCTll6（p53+/+）细胞的细胞凋亡，而相同浓度的5HHMF和5HTMF处理相同的时间对HCTll6（p53-/-）细胞却无影响。另-方面，5HHMF和5HTMF能显著地诱导HCTll6（Bax+/-）细胞产生细胞凋亡，而对HCTll6（Bax/）细胞却作用甚微。三个5羟基多甲氧基黄酮都能增加HCTll6（p53+/+）细胞GO/Gl期细胞数目，而对HCTll6（p53-/-）和HCTll6（p2l-/-）细胞却毫无作用。免疫印迹分析结果表明，5HHMF和5HTMF能显著地增加HCTll6（p53+/+）和HCTll6（Bax+/-）中活化的caspase 3和活化的PARP的含量，而在HCTll6（p53-/-）和HCTll6（Bax-/-）细胞中，5HHMF和5HTMF却只能做弱的增加这两种活化的蛋白的含量。综上所述，我们的结果表明，5羟基多甲氧基黄酮，特别是5HHMF和5HTMF以p53、Bax和p2l依赖性方式来诱导结肠癌细胞凋亡及细胞周期滞留。 3．5-羟基-3，6，7，8，3’，4-_六甲氧基黄酮（5HHMF）对结肠癌细胞的抑制作用 5HHMF具有显著的抑制结肠癌细胞生长的作用，它能诱导细胞周期滞留和细胞凋亡，并能广泛地调节重要的信号转导途径。我们在上述研究的基础进-步深入地剖析了5HHMF抑制人类结肠癌细胞生长的分子作用机制。结果表明，5HHMF能以剂量依赖方式抑制HT29、HCTl6及sW620等多种人类结肠癌细胞的集落形成能力，而且，与以往己报道的结果不同的是5HHMF抑制细胞生长的作用不是通过产生活性氧化物质（R0s）实现的。5HHMF能选择性地改变与细胞膜相关的重要蛋白，例如K Ras，EGFR及它们的下游效应物Akt和NFkR的活性。5HHMF也能有效的地抑制Wnt信号转导通路：它能以剂量依赖方式降低细胞核内B catenin的含量，增加细胞浆内E-cadherin的含量。血管生成对肿瘤的发展有着重要的意义，5HHMF还能以剂量依赖方式有效地抑制血管生成。以上结果表明，5HHMF能从细胞膜、细胞浆、细胞核及血管生成方面来全方位地抑制结肠癌细胞的生长。 4．5-羟基川陈皮素（5HPMtf）和5-羟基橘红素（5HTMF）体内抗结肠癌活性及其药代动力学研究 上述研究表明5HPMF和5HTMF具有很强的抑制人类结肠癌细胞生长及诱导肿瘤细胞凋亡的作用。我们利用氧化偶氮甲烷（AOM、）诱导的结肠癌大鼠模型进一步研究了5HPMF和5HTMF的体内抗结肠癌活性。用AOM皮下注射F344大鼠两次，每周一次，然后喂食脂肪含量为20％并混有5HPMF和5HTMF（O．05％和O．1％）的高脂食物8周后处死病取大肠。AcF（结肠癌早期指标）的形成作为实验的结束点。结肠的ACF用亚甲基蓝染色后在显微镜下进行分析。结果表明5HPMF能以剂量依赖方式降低每只大鼠总的ACF的数目及AC的数目。而且5HPMF的作用明显强于5HTMF的作用，例如，5HPMF在降低总的ACF和highgrade dysplasia的作用都显著强于5HTMF。但是这些体内抗肿瘤结果与体外抗肿瘤研究的结果正好相反：体外研究表明5HTMF在三个5羟基多甲氧基黄酮中具有最强的抑制肿瘤细胞生长及杀死细胞的作用。为了进一步探索体内外实验结果差异的原因，我们对5HPMF和5HTMF进行了入血成分、排泄及脏器分布研究。结果表明，5HPMF和5HTMF的浓度都在60min左右时在血清内达到峰值，并且5HPMF在血清中的浓度是5HTMF的1O倍左右；5HPMF在尿液中总的排泄量和排泄率都高于5HTMF。结合我们的以前研究我们推测5HTMF具有很弱的水溶性，其脂溶性也比5HPMF低，这使其不易透过生物膜被吸收进入血液，因而其在血液中的浓度相对很低，不能起到抑制AcF形成的作用。 5．5HPMF和阿托伐他汀联合使用对结肠癌细胞的协同性抑制效应 5HPMF在橘皮中具有较高的含量并且它还具有较强的抑制人类结肠癌细胞生长的活性，阿托伐他汀是HMG c0A还原酶抑制剂，它也是一种潜在的抗癌药物。在此项研究中我们开创性地研究了一个全新的抗癌策略：低剂量阿托伐他汀和5HPMF联合用药。阿托伐他汀或5HPMF单独使用时可产生很强的抑制结肠癌细胞生长的效应，但是两者联用后可产生更加强大的抑制效应。根据等效线图解法分析得知，低剂量阿托伐他汀和5HPMF联合用药产生的对结肠癌细胞的强大抑制来源于两者的显著协同效应。流式细胞仪的分析结果表明，阿托伐他汀和5HPMF联合用药24h后，能协同性地使大量的细胞滞留在G0/G1期；而联合用药48h或更长时间后，可协同性地诱导显著而广泛的细胞凋亡效应。阿托伐他汀和5HPMF联合用药对肿瘤细胞产生的抑制效应要比单独使用阿托伐他汀或5HPMF产生的效应显著很多。我们进一步的研究表明，阿托伐他汀/5HPMF联合用药所产生的协同效应与增加p2lCipl/Vafl和p27Kipl蛋白的含量；降低CDK 2、CDK 4、CDK 6、cyc¨n Dl、Mcl-1及p-Rb（Ser780）蛋白的含量；及激活caspase级联反应紧密相关。阿托伐他汀/5HPMF联合用药也能选择性地抑制与细胞膜相关的重要蛋白。综上所述，我们的实验结果显示阿托伐他汀/5HPMF联合用药可在抑制人类结肠癌细胞生长和杀死肿瘤细胞方面产生很强的协同效用，这种协同效应是通过广泛地诱导细胞凋亡，造成细胞周期滞留，和调控重要信号转导通路来实现的。我们的研究有力的证明了阿托伐他汀/5HPMF联合用药的光明前景，为下一步的临床实验提供了强有力的证据和生物指标。 综上所述，5羟基多甲氧黄酮相比于其母体全甲氧基化的多甲氧基黄酮具有更强的抑制人类结肠癌细胞增殖，诱导细胞凋亡的作用。5羟基川陈皮素与阿托伐他汀联合使用可协同性地抑制人类结肠癌细胞的生长，增加细胞凋亡。还可以通过抑制表皮生长因子受体（EGFR）激活，降低膜蛋白K-RAS的表达进而抑制其下游信号转导通路实现其抗癌活性。本研究首次对5羟基多甲氧基黄酮进行系统的抗结肠癌研究，也是首次对5羟基多甲氧基黄酮与商业用药阿托伐他汀联合使用进行抗结肠癌研究，此项研究为应用富含5羟基多甲氧基黄酮橘子制品（包括陈皮）作为一种预防和抑制结肠癌的保健品和药品提供了强有力的科学依据，同时为开发新颖中医疗法以及中西医结合疗法开辟了新的途径。此项研究将对公共健康产生积极的影响同时也会大大增加橘子汁工业中废弃的橘子皮及其他副产品的价值。