白术有效成分对巨噬细胞和树突状细胞免疫活性的研究

白术是最常用的中药，为菊科植物白术的根茎，具有利尿、抗炎、抗肿瘤、抗衰老、止痛、调节免疫、降血糖以及抑制代谢活化酶等作用，为药食同源之品。白术的主要活性成分包括白术多糖和白术内酯等。目前研究已发现白术多糖和白术内酯具有多种药理活性。其中，白术多糖具有调节免疫、抗氧化及抗衰老、抗肿瘤、降血糖等作用，而白术内酯药理作用主要涉及对炎症、胃肠运动、离体子宫、肿瘤的影响等。但目前对白术多糖和白术内酯的研究还比较粗浅，因此从细胞和分子水平阐明白术多糖增强免疫作用和调节免疫的机理以及阐明白术内酯类成分抗炎作用机理，对于进一步进行植物功能性因子研究及保健食品开发和医学用药，具有非常重要的意义。 （1）从药食同源之品白术根茎中提取水溶性白术粗多糖，粗多糖经冻融、醇沉分级，蛋白酶法和Sevag法联合脱蛋白得到白术多糖。 （2）本论文研究了白术多糖对巨噬细胞的免疫调节作用及其在细胞和分子水平上的免疫机制。利用流式细胞技术检测白术多糖诱导RAW264.7细胞的吞噬功能情况；利用ELISA方法测定白术多糖诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α、IFN-γ和NO的情况；利用Western blotting检测白术多糖诱导RAW264.7细胞TLR4的表达情况；运用TLR4抗体阻断TLR4，测定RAW264.7细胞的吞噬功能、分泌TNF-α和NO的情况以及p38的活化情况；Western blotting检测白术多糖诱导RAW264.7细胞p38的活化情况；并运用p38抑制剂SB203580抑制p38，检测RAW264.7细胞分泌TNF-α和NO的情况；Western blotting检测白术多糖诱导RAW264.7细胞NF-κB的活化情况；并运用NF-κB的抑制剂PDTC，检测RAW264.7细胞分泌TNF-α、IFN-γ和NO的情况；并运用p38抑制剂SB203580抑制p38，检测RAW264.7细胞NF-κB的活化情况。白术多糖能增强RAW264.7细胞的吞噬功能。研究发现白术多糖能使RAW264.7细胞分泌TNF-α、IFN-γ和NO增加，呈时间和浓度依赖性。白术多糖还能增加RAW264.7细胞TLR4的表达、p38和NF-κB的活性，并且阻断TLR4后，RAW264.7的吞噬能力和分泌TNF-α和NO的功能下降。此外，阻断TLR4后还同时能抑制p38的活化。抑制p38或NF-κB后，RAW264.7分泌TNF-α和NO减少。并且抑制p38后，还同时能抑制NF-κB的活化。由此说明，白术多糖具有增强巨噬细胞吞噬功能、增加TLR4表达和促进TNF-α、IFN-γ和NO分泌作用。我们进一步对其免疫调节的信号通路进行了研究，发现白术多糖对MAPK和NF-κB两条通路都具有正调控作用，因此其免疫调节的作用机制可能是通过上调这两条通路，从而促进细胞因子和生物活性物质的释放而发挥作用。 （3）研究了白术多糖对树突状细胞的免疫调节作用及其在细胞和分子水平上的机制。分离外周血单核细胞，进一步诱导分化为DC；倒置显微镜观察白术多糖对DC形态的影响；利用流式细胞术检测白术多糖对DC细胞吞噬功能影响和细胞表面标志的影响；利用ELISA方法测定白术多糖对DC细胞分泌IL-12和TNF-α的情况；利用Western blotting检测白术多糖对DC细胞TLR4的表达情况；运用TLR4抗体阻断TLR4，测定DC细胞的吞噬功能、分泌IL-12和TNF-α的情况。白术多糖能增强DC的增殖功能和促进IL-12和TNF-α分泌，且呈剂量依赖性。同时，白术多糖可以增加DC细胞TLR4表达，阻断TLR4后，DC分泌IL-12和TNF-α减少。此外，白术多糖可以使巨噬细胞吞噬功能降低。综上所述，白术多糖具有促进DC细胞表面标志上调，降低吞噬能力，促进IL-12和TNF-α分泌和增加TLR4表达，提示白术多糖能够促进DC的分化和成熟。 （4）研究了白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ的抗炎作用及进一步阐明其作用的分子机制。利用MTT方法检测白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ对RAW264.7细胞活性的影响；利用LPS刺激巨噬细胞建立炎症反应模型，对白术内酯Ⅰ进行抗炎作用研究，实验分组：RAW264.7细胞组，LPS+RAW264.7细胞组，LPS+RAW264.7细胞+白术内酯Ⅰ组。我们首先检测了不同浓度的白术内酯Ⅰ抑制TNF-α和IL-6的情况，浓度分别设为25μM、50μM、100μM；此外，LPS刺激巨噬细胞建立炎症反应模型，对白术内酯Ⅲ进行抗炎作用研究，实验分组：RAW264.7细胞组，LPS+RAW264.7细胞组，LPS+RAW264.7细胞+白术内酯Ⅲ组。我们首先检测了不同浓度的白术内酯Ⅲ抑制炎性介质TNF-α、IL-6、PGE2和NO释放的情况，浓度分别设为25μM、50μM、100μM；采用Western blotting检测白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ对MAPK信号通路中磷酸化的JNK1/2、总的JNK1/2、磷酸化的p38、总的p38、磷酸化的ERK1/2和总的ERK1/2以及NF-κB信号通路中的NF-κB活化的影响。采用Western blotting检测白术内酯Ⅰ对LPS诱导的巨噬细胞MD-2、CD14、CR3、SR-A、TLR4和MyD88的表达。研究发现，白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ在1-100μM之间对RAW264.7细胞无毒性。利用LPS100ng/mL诱导RAW264.7，TNF-α、IL-6、PGE2和NO的分泌明显升高。白术内酯Ⅰ可以抑制LPS引起的TNF-α和IL-6分泌，白术内酯Ⅲ可以抑制TNF-α、IL-6、PGE2和NO分泌，呈剂量依赖性。我们进一步对白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ的抗炎机制进行研究，发现白术内酯Ⅰ对MD-2、CD14、SR-A、TLR4、MyD88、p-ERK1/2、p-p38和NF-κB蛋白都具有明显抑制作用，呈剂量依赖性；白术内酯Ⅲ对p-ERK1/2、p-p38、p-JNK1/2和NF-κB具有明显下调作用，呈浓度依赖性。由此可见，白术内酯Ⅰ和白术内酯Ⅲ有抗炎作用，并可以抑制MAPK和NF-κB的活化。因此，抗炎作用机制可能是由于这两条通路的抑制，从而抑制炎性因子和炎性介质释放。