狗脊糖聚物的分离纯化、结构鉴定及抗骨质疏松活性研究

本论文对狗脊(Cibotium barometz)粗糖聚物的体内抗骨质疏松活性进行深入研究。同时对狗脊粗糖聚物进行分离纯化,对获得的均一糖聚物进行结构鉴定。狗脊中的水溶性糖聚物采用经典水提分级醇沉法进行提取,获得三个部位的粗糖聚物分别命名为CB50、CB70和CB90,而水提残渣则用稀碱液浸提,醇沉,得到碱溶性粗糖聚物CBB。本课题组前期体内抗骨质疏松实验结果表明四个部位狗脊粗糖聚物均展现了良好的抗骨质疏松效果。由于CBB的抗骨质疏松效果尤为显著,因此本实验对CBB组大鼠股骨干骺端和腰椎骨进行进一步Micro-CT扫描和三维重建分析,结果显示CBB能够显著增加骨质疏松大鼠股骨骨小梁数量和厚度,降低骨小梁分离度,改善结构模型指数使其由棒状向板状结构转变,说明狗脊碱提粗糖聚物可以显著改善去卵巢骨质疏松模型大鼠股骨干骺端松质骨的骨微结构。基于狗脊粗糖聚物良好的体内抗骨质疏松活性,本实验对狗脊四个部位粗糖聚物CBB、CB50、CB70和CB90进行分离纯化、结构鉴定,并明确其具有抗骨质疏松活性的均一糖聚物成分。首先对各部位糖聚物分别进行脱蛋白、透析和冻干,然后分别经DEAE-Cellulose 52层析柱进行初步分离,再分别经Sephadex G-75凝胶柱进一步纯化,得到五个糖聚物样品CBBP-1、CBBP-2、CBBP-3、CBP70-1-1和CBP70-1-2。经紫外可见光谱扫描表明其均不含有蛋白质和核酸;经比旋光度法和高效凝胶渗透色谱法测定其均为均一糖聚物,分子量分别为1445 Da、10662 Da、122975 Da、12724 Da、3611 Da。采用PMP柱前衍生化-高效液相法分析其单糖组成,完全甲基化-GC-MS分析其糖残基组成,并结合核磁共振波谱分析其糖残基连接位点,获得其一级结构特征。其中CBBP-1为葡甘低聚糖,而CBBP-2、CBBP-3、CBP70-1-1和CBP70-1-2均为杂多糖。此外,这些均一多糖的高级结构则采用刚果红实验、圆二色谱和扫描电镜进行初步研究,刚果红实验和圆二色谱分析结果显示这些均一糖聚物均不含有三股螺旋结构。扫描电镜结果表明:CBBP-1为不规则的片状结构,其表面光滑且有球状突起;CBBP-2为交织在一起的木屑样薄片状,表面粗糙;CBBP-3呈现神经细胞样形态,且树突状分支末端有光滑的球状突起;CBP70-1-1为大小和形状都不规则的片状,其表面呈现尖锐的突起;CBP70-1-2也显示为不规则片状结构,其表面呈现平滑的起伏。这五个均一糖聚物均未见文献报道。