BMP-Smad信号通路在成骨与破骨细胞生成中的作用

骨骼是一种兼具刚性和动态特质的器官,占人体体重的五分之一,能够连续的成型、塑造以及修复,具有运动、保护、支持、造血和内分泌等功能。在生长发育阶段完成后,骨骼将经历一个涉及全新合成与吸收降解这样两个相反作用的动态博弈过程：旧骨质不断地被造血干细胞来源的破骨细胞吸收降解,新骨质不断地由间充质干细胞分化而来的成骨细胞生成。骨生成及骨吸收之间的平衡维持了骨量和骨结构的稳定,破坏该平衡将引发骨硬化和骨质疏松症等骨骼疾病,因此研究该过程的调控机制将有助于人类了解并解决相关的问题。 骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)大量存在于骨基质中,最初被发现可以引起肌肉中异位成骨。成骨细胞和破骨细胞的分化受多种信号通路调控,而其中BMP-Smad就是非常重要的一种。另外,BMP-Smad通路在胚胎发育,成体组织稳态平衡以及肿瘤发生过程中都发挥着重要的作用。 BMPs以Smad1/5/8为(B-Smads)信号传导器。BMPs能够与细胞表面具有丝氨酸、苏氨酸激酶活性的受体BMPRⅠ,BMPRⅡ结合,BMPs首先激活BMPRⅡ,使其磷酸化并进一步激活BMPRⅠ,使BMPRⅠ能够磷酸化Smadl/5/8的C端SXS区域。磷酸化的B-Smad与Smad4形成复合物,在细胞核中积累,并与Smad结合序列或富含GC的序列结合,调控BMP靶基因的转录过程。虽然目前已经确定BMP信号转导在成骨细胞的生成和活化中具有重要作用,但是近期报道发现,BMP-Smad信号转导也间接地在破骨细胞生成中起着重要作用。 血小板衍生生长因子(Platelet-derived growth factor,PDGFs)是一类可以促进细胞增殖和迁移的生长因子,在胚胎发育和成体组织稳态的控制中具有重要作用。根据表达的组织特异性,PDGF可被分为A-D四类。PDGF分子通过与细胞表面的PDGF特异性受体(Platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)结合发挥作用。PDGFR具有酪氨酸激酶活性,不同的PDGF对不同的受体有差异性作用,如PDGF-AA主要激活PDGFRα。PDGF引起的信号反应被精密调节,其中一种调节机制是内吞和溶酶体介导的PDGFR降解,该调节机制需要通过配体结合和PDGFR的自身磷酸化实现,同时,该调节机制也是一种可以减弱PDGF信号的反馈调节机制。 PDGF在骨发育中同样具有重要的作用,PDGFRα的缺失会导致骨骼发育与生殖发育的缺陷。在细胞水平上,PDGF被证明可以促进间充质干细胞的增殖。因此,PDGF可以作用于成纤维细胞,间充质干细胞和其他种类的细胞,并使这些细胞在成体的伤口愈合和骨折修复中发挥重要的作用。所以,PDGF也许可以作为一种促进伤口愈合和骨折修复的治疗试剂。尽管PDGF-BB已被报道可以抑制成骨细胞分化,但是PDGF-AA对成骨细胞分化的作用尚不清楚。PDGF如何影响并决定间充质单细胞增值或分化尚不清楚。 维生素D(vitamin D,VD)是由7-脱氢胆固醇通过紫外线照射,并在皮肤中合成,在日常饮食中也有微量存在,是一种常见的补充剂。1,25-二羟维生素D (1,25(OH)2D3)是VD的主要激素形式,负责其大部分的生物作用。VD的主要作用是增加钙的肠吸收,保证骨矿化的需要,同时,VD还在生殖、免疫、心血管系统、毛发增殖和肿瘤发生等其他许多生理功能中起作用。除皮肤外,包括间充质干细胞、成骨细胞、单核细胞和破骨细胞等多种类的细胞都可以分泌VD。VD通过与其受体(vitamin D receptor,VDR)吉合激活MAPKs和Akt等相关信号通路。VD的营养性缺乏或改变会引起佝偻病或软骨病,补充VD被认为可以预防骨质疏松,药理学剂量的活性VD及其类似物通过促进骨形成并抑制骨吸收来增加骨量和提高骨密度。此外,VD还可以通过影响RANKL(Receptor Activator for Nuclear Factor-κB Ligand),OPG(Osteoprotegerin)和其他骨细胞发育相关分子的分泌直接影响破骨细胞发育。然而,VD代谢物对骨的影响十分复杂,这种影响因物种,骨的发育阶段及软骨细胞的差异而变化,同时在不同的检测时间也表现出作用差异,因此,药理剂量的VD防止骨质疏松的原因还需要进一步探索研究。 本研究是山东大学医学院人体解剖与组织胚胎学教研室与上海交通大学Bio-X研究院的合作研究项目,旨在研究BMP-Smad信号通路的两种新型调节方式及其在间充质干细胞和破骨细胞分化中的作用,并进一步研究阐明其作用机制,为骨相关疾病的治疗提供理论依据。基于以上研究背景,本文开展了一系列相关研究,并取得了以下成果： 1. PDGF-AA通过BMP-Smad1信号通路激活MSC的成骨分化和迁移 遗传学研究表明,PDGF分子同BMP分子一样可以在间充质干细胞中实现增殖,并在骨髂发育和骨折修复等过程中发挥重要作用。本文以分离自成年小鼠骨髓的间充质干细胞为研究对象,检验了PDGF与BMP信号通路之间是否存在联系。研究发现PDGF-AA显著地激活了Smad1/5/8,而PDGF分子不能激活应答TGF-β信号的Smad分子-Smad2/3,这表明PDGF-AA与BMP-Smad1/5/8信号通路间存在特殊关系。PDGF-AA在间充质干细胞中是通过BMPR I A激活Smad1/5/8的。但是,PDGF-AA不是改变BMP及其受体的表达。为检测PDGF-AA引发的Smad1/5/8激活的作用,我们研究了间充质干细胞的成骨分化过程,这是由BMP-Smad1/5/8信号通路通过如Runx2,Osterix和Atf4等转录因子促进的主要细胞事件。研究结果表明,PDGF-AA主要通过BMP-Smad1/5/8-Runx2/OSX/Atf4轴激活了间充质干细胞的成骨分化。侵袭小室实验表明,PDGF-AA对间充质干细胞的迁移的作用至少部分的被BMP-Smad1及其靶基因包括Id1、Twist1和Atf4介导。 2. PDGF-AA对Smad1/5/8的激活需PDGFRa降解释放BMPR I A 在已经了解PDGF-AA诱导间充质干细胞Smad1/5/8激活的生物学意义后,为了明确Smad1/5/8激活应答于PDGF-AA的分子机制,我们开展了进一步的研究。已经排除了Smad1/5/8激活应答于PDGF-AA是由BMP的改变引起的可能性,在间充质干细胞中PDGF-AA引起了PDGFRα的降解,为了检验PDGFRα的下调是否在PDGF-AA诱导的Smad1/5/8激活中发挥作用,我们通过采用siRNA、共表达以及免疫共沉淀等一系列技术手段开展了相关研究。结果表明,PDGFRα通过与BMPR Ⅰ A形成结合物,可能与BMPR Ⅱ竞争与BMPR Ⅰ A的结合并因此干扰BMPR Ⅰ与BMPR Ⅱ的互相作用,而这是BMPR Ⅰ激活与Smad1/5/8磷酸化所必需的。为了检验这种可能性,我们进一步进行了免疫共沉淀实验,发现PDGFRα的表达导致了BMPR Ⅰ-Ⅱ复合物形成的减少。这些结果说明PDGFRα通过与BMPR Ⅰ A结合影响BMPR Ⅰ与BMPR Ⅱ的相互作用,从而抑制了BMP-Smad1的激活。 3.1α,25(OH)2D3通过BMP-Smadl信号通路抑制破骨细胞形成从而增加骨量 一直以来,人们普遍认为VD对骨形成是依靠增加钙吸收和促进成骨细胞分化实现。但是本文研究发现,1α,25(OH)2D3是通过激活BMP-Smad1信号通路从而抑制破骨细胞分化而抑制骨吸收的。在体实验结果表明,改变小鼠骨量的主要因素是破骨细胞,1α,25(OH)2D3是通过影响破骨细胞数目及骨吸收速率增加小鼠骨量。包括小鼠尿液中尿脱氧吡啶酚等骨吸收的主要生化指标变化也证明了这一点。已有的相关研究认为,1α,25(OH)2D3可以促进破骨细胞分化,甚至被作为破骨细胞分化诱导剂。但是,我们发现1α,25(OH)2D3对破骨细胞的作用随破骨细胞发生阶段而不同。体外TRAP染色实验结果表明,破骨细胞形成前期(增殖期)没有RANKL作用时,1α,25(OH)2D3阻碍了破骨细胞的形成,而与RANKL同时或在RANKL后加入培养基时,1α,25(OH)2D3却促进了破骨细胞的分化。Real-time PCR的相关结果也证明了这一点,1α,25(OH)2D3在不同阶段,对破骨细胞分化的标志基因PU.1,MTTF, c-FOS,NFATcl,CAT K,intergrrimβ3,TRAP,DC-STAMP分别具有激活和抑制的作用。这些结果说明,1α,25(OH)2D3在破骨细胞分化中具有双向作用,即在分化初期具有抑制作用,但在分化后期具有促进作用。 为了解释1α,25(OH)2D3是如何抑制破骨细胞形成的,我们分析了多种相关信号通路,发现1α,25(OH)2D3在RAW264.7和破骨细胞中都可以促进Smad1/5/8磷酸化,增加Smad1的蛋白水平,激活BMP-Smadl信号通路。在小鼠股骨冰冻切片中,免疫组织化学染色结果也证明了这一点。小鼠骨组织WB和Real-timePCR的实验结果也显示了1α,25(OH)2D3对BMP-Smadl具有激活作用。双荧光素酶检测实验和染色质免疫共沉淀实验证明VDR在Smad1启动子上有结合位点并促进Smad1合成。 BMP2对破骨细胞同样具有双向作用,与1α,25(OH)2D3相同,在破骨细胞分化前期作用时抑制破骨细胞形成,而在RANKL作用后发挥了促进作用。在BMPR I A条件性敲除的破骨细胞中,TRAP染色实验结果显示,与对照组相比,破骨细胞的分化有增加。Real-time PCR结果显示破骨细胞分化前期的标志性基因被激活,而后期表达的基因被抑制。因此,抑制BMP受体促进了破骨细胞的早期分化但是阻碍了破骨细胞的成熟。 除了敲除BMPR I A,使用BMP受体抑制剂LDN-193189也具有相同作用。在体外试验中,在破骨细胞中条件性敲除BMPR I A跟LDN-193189与1α,25(OH)2D3同时作用消除了1α,25(OH)2D3对破骨细胞分化的抑制作用。在体内实验中,对1α,25(OH)2D3喂饲的小鼠同时注射LDN-193189,其骨量增加较只喂饲1α,25(OH)2D3的小鼠减少了一半,在lysM-Cre; Bmprld(?)小鼠中,喂饲1α,25(OH)2D3并没有改变小鼠骨量及其他骨吸收指标,这些实验结果说明1α,25(OH)2D3需通过BMP-Smad1通路发挥对骨吸收的抑制作用。 4.1α,25(OH)2D3通过BMP-SMAD1信号通路抑制NF-κB信号通路阻碍破骨细胞形成 由于BMP-Smad1并不能直接影响破骨细胞分化,而RANKL主要是通过激活NF-κB通路来促进破骨细胞分化,为了明确1α,25(OH)2D3和BMP-Smad信号通路调节破骨细胞分化的机制,我们检测了1α,25(OH)2D3对NF-κB信号通路的作用。在体外实验中,我们发现1α,25(OH)2D3和BMP2在RANKL作用前抑制了IκB-a的降解从而抑制了NF-κB信号通路,而同时向样品中加入或在其后加入时不能起到这种抑制的作用,这些结果说明1α,25(OH)2D3通过BMP-Smadl信号通路抑制NF-κB信号通路从而阻碍破骨细胞形成。 综上所述,我们发现了BMP-Smad信号通路调节骨细胞分化的两种新机制：1)在间充质干细胞中,PDGFRa通过与BMPRIA形成复合物抑制BMP-Smad信号通路,PDGF-AA通过降解其受体激活了BMP-Smad信号通路进而诱导了MSC的成骨分化和迁移；2)维生素D和BMP通过NF-κB信号通路介导对破骨细胞分化都具有双向作用。本研究在BMP-Smad1和NF-κB两条信号通路间建立了联系,在破骨细胞发育与骨吸收的机制研究中具有重要的理论和现实意义。